基于單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)識別糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細胞

楊 蕤，萬生芳，張 磊，李榮科，楊雅麗，王同亮，張亞男，魏昭輝，白曉丹，荀敏奇

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）的微血管并發(fā)癥之一，長期高血糖導(dǎo)致腎損傷，病變可逐漸累積全腎，以持續(xù)性白蛋白尿和（或）腎小球濾過率（eGFR）進行性下降為主要特征，可發(fā)展為終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）。腎小球結(jié)構(gòu)和功能的損傷在DKD 發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，其病理改變主要包括腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增寬及腎小球硬化[1]。DKD 發(fā)病機制非常復(fù)雜，多與遺傳因素、糖脂代謝紊亂、血流動力學(xué)改變、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等諸多病理生理機制相關(guān)[2]，而針對DKD 發(fā)病相關(guān)細胞的研究相對較少。本研究通過單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究DKD 患者和健康人腎組織細胞轉(zhuǎn)錄的差異，與大量數(shù)據(jù)的腎小球表型數(shù)據(jù)集比對后，通過Scissor 從單細胞數(shù)據(jù)中準確地識別出與表型基因最相關(guān)的腎小球細胞，根據(jù)不同細胞類型進行細胞亞群鑒定，選擇其中的關(guān)鍵細胞篩選差異基因，結(jié)合基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）探討差異基因富集情況及富集通路的表達情況，識別在DKD 發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵性作用的細胞，以期為進一步探究DKD 發(fā)病機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 DKD 單細胞測序數(shù)據(jù) 在基因表達數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）將物種設(shè)置為“Homo Sapiens”，以“（DKD）AND（Single cell）”為檢索式搜索得到GSE131882 數(shù)據(jù)集，樣本組織來源為腎臟，包含6個樣本，其中3 個正常樣本對照（GSM3823939～GSM3823941），3 個DKD 患者樣本（GSM3823942～GSM3823944），見表1。通過nawo 對原始FASTQ 文件進行表達定量。按照Seurat 包中的NormalizeData函數(shù)對所有的數(shù)據(jù)進行標準化，F(xiàn)indVariableFeatures函數(shù)識別每個樣本高差異度表達特征，使用Scale－Data 函數(shù)進行歸一化，設(shè)置參數(shù)npcs=30 進行線性降維。隨即去除核糖體或線粒體基因表達大于10%的細胞（圖1），并通過harmony 方法進行樣本批次校正，F(xiàn)indClusters 功能對細胞進行聚類，參數(shù)resolution=0.5；使用RunUMAP 和RunTSNE 功能進行UMAP 和TSNE 聚類，參數(shù)為dims=1∶20。最終得到11 個細胞群體，利用marker 基因進行細胞類型鑒定。使用scCATCH 和手動注釋結(jié)合的方法鑒定整合后的細胞類型。選擇對應(yīng)的組織類型進行細胞注釋，結(jié)合文獻報道以及CellMarker 網(wǎng)站進行手工校正。

圖1 各細胞中核糖體與線粒體基因表達量

表1 GSE131882 數(shù)據(jù)集患者基本情況

1.2 DKDbulk 測序數(shù)據(jù) 在GEO 數(shù)據(jù)庫中將物種設(shè)置為“Homo Sapiens”，以（DKD）AND（glomerulus）為檢索式搜索，選取GEO 數(shù)據(jù)庫中的GSE96804 數(shù)據(jù)集，包含61 個樣本，41 個DKD 患者樣本（GSM2544275～GSM2544315）和20 個正常樣本對照（GSM2544316～GSM2544335）。從GEOquery 下載表達量及表型數(shù)據(jù)，根據(jù)GPL17586 注釋平臺文件將探針定量注釋為基因表達量。進一步在limma 包中的Normalize Between Arrays 進行四分位數(shù)校正。

1.3 DKD 相關(guān)重要細胞類型識別 將GSE96804 作為表型數(shù)據(jù)，在R4.2.0 版本中Scissor 包識別DKD疾病中關(guān)鍵細胞亞群。Scissor 的3 個輸入數(shù)據(jù)源分別是單細胞表達矩陣、批量表達矩陣和目標表型；根據(jù)輸入源計算相關(guān)矩陣和細胞-細胞相似性網(wǎng)絡(luò)，將其與表型進一步整合到網(wǎng)絡(luò)正則化稀疏回歸模型中，選擇最相關(guān)的細胞亞群；根據(jù)估計的回歸系數(shù)的符號，分為剪刀陽性（Scissor+）細胞和剪刀陰性（Scissor-）細胞，表示與目標表型呈正相關(guān)和負相關(guān)；隨后通過可靠性、顯著性檢驗確定所選數(shù)據(jù)是否適合表型-細胞關(guān)聯(lián)。

1.4 差異基因表達及GSEA 篩選關(guān)鍵細胞 在R4.2.0版本中g(shù)gplot2 包繪制差異基因表達情況火山圖。使用clusterProfiler 包的gseKEGG 函數(shù)對DKD 發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵細胞的表達數(shù)據(jù)進行GSEA 富集分析，并通過Enrichplot 包進行結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 細胞類型聚類分析 最終得到的細胞數(shù)據(jù)類型包括近曲小管上皮、連接小管上皮、髓袢上皮、遠曲小管上皮、成纖維細胞、腎閏細胞、腎β-閏細胞、腎毛細血管內(nèi)皮細胞、腎小球血管上皮細胞、間充質(zhì)細胞以及巨噬細胞（圖2）。maker 基因在對應(yīng)細胞類型中表達情況見圖3。

圖2 細胞類型及分布情況

圖3 細胞標記基因熱圖

2.2 細胞數(shù)量統(tǒng)計分析 細胞數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果顯示，DKD 患者腎組織中：巨噬細胞為2.96%、近曲小管上皮細胞為16.20%、連接小管上皮細胞為23.34%、髓袢上皮細胞為17.27%、遠曲小管上皮細胞為9.73%、成纖維細胞為9.50%、腎閏細胞為6.58%、腎毛細血管內(nèi)皮細胞為5.80%、腎小球血管上皮細胞為3.08%、腎β-閏細胞為3.06%、間充質(zhì)細胞為2.47%。健康人腎組織中：巨噬細胞為0.32%、近曲小管上皮細胞為27.74%、連接小管上皮細胞為16.96%、髓袢上皮細胞為15.35%、遠曲小管上皮細胞為14.13%、成纖維細胞為6.58%、腎閏細胞為8.54%、腎毛細血管內(nèi)皮細胞為4.01%、腎小球血管上皮細胞為2.70%、腎β-閏細胞為2.03%、間充質(zhì)細胞為1.59%（圖4）。與健康人腎組織比較，DKD 患者腎組織中巨噬細胞比例增加2.64%、近曲小管上皮細胞比例降低11.54%、連接小管上皮細胞比例增長6.38%、髓袢上皮細胞比例增加1.92%、遠端小管上皮細胞比例降低4.40%、成纖維細胞比例增長2.92%、腎閏細胞比例降低1.96%、腎毛細血管內(nèi)皮細胞比例增長1.79%、腎小球血管上皮細胞比例增長0.38%、腎β-閏細胞比例增長1.03%、間充質(zhì)細胞比例增長0.88%。

圖4 DKD 患者及健康人腎組織細胞類型的分布情況及細胞比例

2.3 DKD 與健康人相關(guān)細胞亞群比較 多種細胞類型參與DKD 發(fā)生發(fā)展過程（圖5A），篩選得出Scissor+細胞共2340 個，Scissor-細胞854 個（圖5B）。將DKD 和健康人對比，健康人中Scissor+細胞僅占66%，而DKD 患者Scissor+細胞占80%（圖5C）；進一步檢查細胞比例結(jié)果顯示，Scissor＋占比超過50%的細胞有巨噬細胞、間質(zhì)細胞如腎毛細血管內(nèi)皮細胞、腎閏細胞、腎遠端小管上皮細胞、腎β-閏細胞、成纖維細胞、間充質(zhì)細胞和連接小管上皮細胞（圖5D）。

圖5 DKD 患者與健康人細胞亞群比較

2.4 差異基因分析和GSEA 分析 綜合上述分析結(jié)果，選取Scissor+占比超過50%細胞類型中細胞數(shù)量差異最顯著的5 類細胞，最終選擇巨噬細胞、間充質(zhì)細胞、腎β-閏細胞、腎毛細血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞，并對Scissor 結(jié)果有區(qū)別的4 類細胞篩選差異基因，并繪制火山圖和GSEA 圖。DKD 患者間充質(zhì)細胞中差異基因共366 個，基因表達上調(diào)有108 個，分別為EGR1、ZFP36、FOSB、FOS、PDK4、BTG2 等；下調(diào)基因有258 個，分別為ITGA1、CARMN、A2M、NBEAL1、RBPMS、CRIM1 等；差異基因富集在Toll 樣受體信號通路、B 細胞受體信號通路、心肌收縮、致心律失常性右心室心肌病等（圖6）。腎β-閏細胞中差異基因共292 個，基因表達上調(diào)有271 個，分別為DNALI1、EGR1、ZFP36、SLC6A6、CYB561、ID1 等；下調(diào)基因有21 個，分別為IL-18、ATP6V0D2、SF1、PNISR、SF3B1、SPTLC3 等；差異基因富集在mTOR 信號通路、結(jié)直腸癌、賴氨酸降解等（圖7）。腎毛細血管內(nèi)皮細胞中差異基因共361個，基因表達上調(diào)有355 個，分別為EGR1、ZFP36、SLC39A4、ITGB2、FAM110D、SSX2IP 等；下調(diào)基因有26 個，分別為DDX5、MEIS2、ZNF207、ZRANB2、ANKRD36、HNRNPH1 等；差異基因富集在氧化磷酸化通路（圖8）。成纖維細胞中差異基因共78 個，其中上調(diào)基因共51 個，分別為EGR1、ZFP36、FOS、ERRF11、GADD458、PDK4 等；下調(diào)基因共27 個，分別為ITGB8、ATP13A3、ITGAV、GLS、PROM1、DCDC2等；差異基因多富集在MAPK 信號通路、ECM 受體相互作用信號通路、黏著斑信號通路等（圖9）。

圖6 間充質(zhì)細胞差異基因通路富集信息

圖7 腎β-閏細胞差異基因通路富集信息

圖8 腎毛細血管內(nèi)皮細胞差異基因通路富集信息

圖9 成纖維細胞差異基因通路富集信息

3 討論

本研究通過單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析DKD 患者和健康人腎小球細胞轉(zhuǎn)錄變化，對細胞類型聚類分析得到的細胞類型進行細胞數(shù)量統(tǒng)計分析可知，巨噬細胞、連接小管上皮、髓袢上皮、成纖維細胞、腎毛細血管內(nèi)皮細胞、腎小球血管上皮細胞、腎β-閏細胞以及間充質(zhì)細胞占比顯著上升。選取GSE96804 作為表型數(shù)據(jù)，并使用Scissor 進行細胞亞群鑒定，結(jié)果顯示在DKD 患者腎小球組織中巨噬細胞、間充質(zhì)細胞、腎β-閏細胞、腎毛細血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、遠曲小管上皮細胞在Scissor+細胞中比例明顯高于Scissor-細胞，即以上細胞與DKD 發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)。隨后篩選出Scissor+占比超過50%的細胞類型中細胞數(shù)量最顯著的5 類細胞，包括巨噬細胞、間充質(zhì)細胞、腎β-閏細胞、腎毛細血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞，推斷其細胞數(shù)量的改變可能與DKD 的發(fā)病有密切聯(lián)系。

此外，本研究結(jié)果表明，巨噬細胞數(shù)量在DKD與健康人中差異較大，并且巨噬細胞均為Scissor+細胞，提示巨噬細胞與DKD 發(fā)生呈正相關(guān)。近年來有研究認為[3，4]，慢性炎癥是患者腎臟病理結(jié)構(gòu)和生理功能改變的基礎(chǔ)，而慢性炎癥過程中巨噬細胞募集對DKD 發(fā)生發(fā)展起到推進作用。在DKD 患者腎活檢和實驗動物模型中，腎小球和腎間質(zhì)中巨噬細胞是含量最多的浸潤性白細胞[5]，其浸潤程度與尿蛋白、血肌酐等各項腎功能指標升高密切相關(guān)[6]，且與腎小球硬化、腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化有關(guān)[7]。在一項使用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的CD11b-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠糖尿病模型的研究中，經(jīng)過白喉毒素（DT）清除巨噬細胞后可明顯減少尿蛋白量，并顯著改善腎小球組織改善與腎組織巨噬細胞募集[8]。因此，減輕巨噬細胞浸潤程度可能是緩解DKD 腎臟損傷的新方向。

腎組織固有的間質(zhì)細胞數(shù)量改變與DKD 的發(fā)展有密切聯(lián)系，研究數(shù)量較多的當(dāng)屬間充質(zhì)細胞。間充質(zhì)細胞又稱間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC），是具有自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞，能夠發(fā)揮多種治療作用，包括促進血管生成、防止細胞凋亡、抑制炎癥和調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)動力學(xué)等，從而改善組織微環(huán)境和促進組織再生[9]。研究表明[10]，在高糖環(huán)境中，MSC 能夠通過減少腎臟細胞凋亡、調(diào)節(jié)自噬、改善炎癥反應(yīng)、改善氧化應(yīng)激、抑制纖維化等途徑治療DKD。本研究中細胞數(shù)量結(jié)果顯示，相較于健康人，DKD 患者間充質(zhì)細胞比例增長0.88%，證實DKD 疾病過程中機體可能通過間充質(zhì)細胞的增殖進而保護腎功能，延緩疾病進展。

DM 狀態(tài)下MSC 直接傳遞到腎臟或遷移到腎間質(zhì)間隙，可能會啟動與腎近端小管上皮細胞（RPTEC）的旁分泌功能。同時，MSC 可通過RPTEC對炎癥介質(zhì)釋放起調(diào)節(jié)作用，可能對單核細胞來源的巨噬細胞產(chǎn)生影響，下調(diào)促炎細胞因子的產(chǎn)生并抑制炎癥信號通路。在DKD 發(fā)病過程中，足細胞和腎小管上皮細胞自噬功能受損，MSC 可通過抑制mTOR 信號通路提高腎臟細胞自噬功能，保護腎臟[11]。又有研究發(fā)現(xiàn)[12]，MSC 可以顯著改善腎臟纖維化，縮小DKD 小鼠腎臟的纖維化區(qū)域，并且降低如Ⅰ型膠原蛋白和纖連蛋白等促纖維化分子的表達水平上。由MSC 分化出的脂肪間充質(zhì)干細胞能較好地抑制腎小管上皮細胞分化，同時減輕高糖狀態(tài)對腎小球損傷、足細胞的損傷以及細胞外基質(zhì)沉積，延緩腎纖維化進展[13，14]；另骨髓間充質(zhì)干細胞可以通過外泌體、生長因子和細胞因子發(fā)揮旁分泌作用，加速腎臟修復(fù)[15]。本研究中GSEA 結(jié)果顯示，間充質(zhì)細胞差異基因有EGR1、ZFP36、FOSB、ITGA1、RBPMS 等，目前通過調(diào)節(jié)腎組織間充質(zhì)細胞中以上基因表達治療DKD 的研究較少，后續(xù)可增加相關(guān)實驗驗證，為DKD 治療提供新思路。

本研究中間充質(zhì)細胞、腎β-閏細胞、腎毛細血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞的GSEA 分析結(jié)果顯示，Toll 樣受體信號通路、氧化磷酸化通路、ECM 受體相互作用以及黏著斑信號通路在多個差異基因富集結(jié)果中出現(xiàn)，可能在DKD 疾病進展中起重要作用。Toll 樣受體信號通路是免疫中重要的一環(huán)，應(yīng)激或損傷的細胞可以釋放相關(guān)因子激活Toll 樣受體信號通路，Toll 樣受體信號級聯(lián)可以促進炎癥基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)無菌炎癥的發(fā)生，TLR2 和TLR4 在腎臟炎癥和纖維化中起主要作用[3，16]。研究表明[17]，TLR4 敲除糖尿病小鼠可降低NF-κB 活性和炎癥細胞因子的釋放及腎臟纖維化。此外，線粒體通過氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生ATP，而線粒體功能障礙是DKD 的重要原因，并且先于DKD 腎損害[18]，調(diào)控線粒體氧化磷酸化途徑對高血糖誘導(dǎo)的DKD 有保護作用[19]。DKD 中足細胞損傷可導(dǎo)致黏著斑激酶激活，導(dǎo)致足突的收縮和消失，通過抑制黏著斑激酶激活改善腎小球濾過功能[20，21]。而有研究表明[22]，高糖環(huán)境對足細胞黏著斑表達無明顯影響，但會明顯促進黏著斑磷酸化。

綜上所述，DKD 患者腎小球中巨噬細胞大量募集可能是其發(fā)生的重要原因，腎小球固有間充質(zhì)細胞、腎β-閏細胞、成纖維細胞、腎毛細血管內(nèi)皮細胞數(shù)量改變可能與DKD 疾病進展密切相關(guān)，間充質(zhì)細胞可能對DKD 的治療起到關(guān)鍵性作用。目前針對腎毛細血管內(nèi)皮細胞、腎β-閏細胞研究較少，有望成為新的DKD 發(fā)病機制研究方向，然而本研究僅為理論研究，后續(xù)可進行實驗研究驗證該結(jié)果。