繪制小鼠腦圖譜的探險

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空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)MERFISH展現(xiàn)小鼠腦切片中各式各樣的細(xì)胞簇

圣地亞哥·拉蒙-卡哈爾（Santiago Ramóny Cajal）在19世紀(jì)后期極為細(xì)致地描繪了神經(jīng)組織，對神經(jīng)生物學(xué)產(chǎn)生了革命性的影響。這位西班牙生理學(xué)家和科學(xué)家花費(fèi)多年時間，一絲不茍地利用顯微鏡進(jìn)行研究，通過圖像展現(xiàn)腦中獨(dú)特的細(xì)胞形態(tài)學(xué)。

“卡哈爾的工作讓我們意識到腦中的細(xì)胞與眾不同，細(xì)胞形態(tài)與其他器官的截然不同，這在其他地方是看不到的。”馬薩諸塞州坎布里奇麻省理工-哈佛大學(xué)博德研究所的神經(jīng)科學(xué)家埃文·馬科斯科（Evan Macosko）評價道。

拉蒙-卡哈爾繪制的圖像為腦如何實(shí)現(xiàn)其功能提供了最初的線索：腦從調(diào)控血壓和睡眠到控制認(rèn)知和情緒，或許都能夠定位到細(xì)胞層面。

然而，腦的關(guān)鍵信息卻依舊是空白。哈佛大學(xué)生物物理學(xué)家莊小威認(rèn)為：為了從基礎(chǔ)層面理解腦，我們迫切需要明確其中的細(xì)胞種類、細(xì)胞的組織方式，以及細(xì)胞間如何交互。

莊小威繼續(xù)解釋道，神經(jīng)科學(xué)家需要的是一種系統(tǒng)鑒定腦細(xì)胞種類，并繪制圖譜的方法。如今研究者正接近這一目標(biāo)（至少在小鼠腦中）。通過結(jié)合高通量單細(xì)胞RNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)——這些技術(shù)能夠鑒定單個細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)情況，以及這些細(xì)胞的定位——研究者正繪制迄今為止最為全面的小鼠腦圖譜。關(guān)鍵的后續(xù)步驟在于研究這些分子水平鑒定得到的細(xì)胞種類的具體功能，并結(jié)合各種腦圖譜以創(chuàng)建統(tǒng)一的圖譜資源，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域。

繪制腦圖譜

小鼠是極為強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)平臺，神經(jīng)科學(xué)家可以在小鼠中以各種無法在人腦中實(shí)現(xiàn)的方式研究腦的功能。光遺傳學(xué)（利用經(jīng)過基因改造的實(shí)驗(yàn)動物，科學(xué)家可以通過光來控制細(xì)胞的活動）等工具能夠探究特定神經(jīng)元如何影響行為，而這些操縱手段無法用于人類，也不符合倫理規(guī)范。

單細(xì)胞腦圖譜通過基因表達(dá)譜鑒定細(xì)胞種類，這種方法可以溝通這兩個物種。斯德哥爾摩卡羅林斯卡研究所的神經(jīng)科學(xué)家司登·林納爾松（Sten Linnarsson）表示，如果研究者對人類的特定細(xì)胞種類感興趣，可以利用基因表達(dá)模式尋找到小鼠中的同種細(xì)胞，并加以操縱。基因表達(dá)同樣為研究者提供了一種鑒定腦細(xì)胞更加細(xì)致的方法，使得傳統(tǒng)上利用物理結(jié)構(gòu)、定位、細(xì)胞連接和放電模式的方法顯得相當(dāng)粗糙。

林納爾松等人利用單細(xì)胞RNA測序繪制了這種綜合性的圖譜。早期研究主要聚焦特定腦區(qū)，比如大腦皮層——這是腦的外層。接著在2018年，兩個研究團(tuán)隊(duì)將這種技術(shù)拓展到了全腦水平。林納爾松團(tuán)隊(duì)的一個研究對小鼠腦細(xì)胞、脊髓和外周神經(jīng)系統(tǒng)中接近50萬個細(xì)胞進(jìn)行了分析。利用計算機(jī)算法基于基因表達(dá)模式對細(xì)胞進(jìn)行分類，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了265個“細(xì)胞簇”，每個簇代表一種在分子水平上不同的細(xì)胞種類。而馬科斯科參與其中的哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院和博德研究所的另一項(xiàng)研究，則在69萬個小鼠腦細(xì)胞中鑒定得到了565個細(xì)胞簇。

這些細(xì)胞簇中包含一些從未被報道過的細(xì)胞類型。以林納爾松的研究為例，發(fā)現(xiàn)了7種星形細(xì)胞，這是一種非神經(jīng)元細(xì)胞，功能相當(dāng)豐富，從為神經(jīng)元提供能量到維持神經(jīng)元連接。而在這之前，科學(xué)家只鑒定出4種主要的星形細(xì)胞種類。

然而，明確存在的細(xì)胞種類并不等于明確其定位。“兩篇論文中都缺乏空間維度。”馬科斯科評論道。

研究者需要一種方法在鑒定每個細(xì)胞中基因表達(dá)的同時，還要精確定位細(xì)胞在腦中的位置。這時，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)便有了用武之地。

描繪細(xì)胞多樣性

2015年，莊小威團(tuán)隊(duì)首次公布了一種空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)——多重抗誤差矯正熒光原位雜交（MERFISH）技術(shù)。該技術(shù)為每一種RNA分配條碼（一個獨(dú)特的DNA探針），并進(jìn)行數(shù)輪顯微成像系統(tǒng)性地破解條碼。這些條碼具有“抗誤差”的功能：這些序列即使被誤讀數(shù)次，也不會被錯認(rèn)為其他條碼。

MERFISH能夠在培養(yǎng)的人類細(xì)胞中同時解析超過1 000個基因，研究者也嘗試?yán)眠@一技術(shù)解析小鼠的腦，建立特定腦區(qū)的圖譜并比較鼠腦和人腦間的細(xì)胞組織差異。此外，他們還發(fā)現(xiàn)人的部分大腦皮層相比小鼠對應(yīng)腦區(qū)，含有膠質(zhì)細(xì)胞（一組非神經(jīng)元細(xì)胞，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞——腦中特有的免疫細(xì)胞）的比例更高，以及人大腦皮層神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞間的交互相對于小鼠要更多。

現(xiàn)如今，莊小威和同事們將MERFISH技術(shù)應(yīng)用于全腦水平。研究團(tuán)隊(duì)利用這一技術(shù)解析成年小鼠腦中約800萬個細(xì)胞，并將這些數(shù)據(jù)與同一批細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)相整合，發(fā)現(xiàn)了超過5 000個具有不同轉(zhuǎn)錄組特征的細(xì)胞簇。研究團(tuán)隊(duì)于2023年3月將這一結(jié)果以預(yù)印本的形式發(fā)表于《生物學(xué)檔案》（bioRxiv），這些研究的正式結(jié)果也正陸續(xù)出版。

另一個同類研究由華盛頓西雅圖艾倫腦科學(xué)研究所所長曾紅葵指導(dǎo)進(jìn)行，同樣將單細(xì)胞RNA測序與MERFISH技術(shù)相結(jié)合。（曾紅葵和莊小威的研究團(tuán)隊(duì)都參與了上述兩項(xiàng)研究。）盡管這兩項(xiàng)研究應(yīng)用的技術(shù)相似，關(guān)注的其實(shí)是不同的問題。第一個研究的重點(diǎn)在于空間梯度——這是一種細(xì)胞簇間的基因表達(dá)譜的漸變特征，以及空間模塊，即分子水平上具有差異的腦區(qū)。第二個研究則通過DNA結(jié)合蛋白，即轉(zhuǎn)錄因子來鑒定不同的細(xì)胞種類。“我們的結(jié)果僅僅是皮毛，”莊小威表示，“這一數(shù)據(jù)集為腦的分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)提供了豐富的見解，也為將來的研究提供了富有價值的資源。”

第三個研究則由馬科斯科和同事完成，他們利用一種不同的空間組學(xué)方法。馬科斯科并沒有使用依賴顯微鏡的MERFISH技術(shù)，而是采取Slide-seq測序方法。這一技術(shù)能夠?qū)⒔M織樣本中的細(xì)胞RNA高效地轉(zhuǎn)移到種滿微珠的表面，而這些微珠帶有條碼標(biāo)記。研究人員可以利用已知的帶條碼微珠的定位，明確組織中相關(guān)RNA的具體位置。而將這種技術(shù)和單核RNA測序相結(jié)合，就能夠報告細(xì)胞核中的基因轉(zhuǎn)錄情況，而非整個細(xì)胞的情況。由此，馬科斯科團(tuán)隊(duì)繪制了自己的小鼠腦圖譜。

這三項(xiàng)研究或多或少都受到了美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）腦計劃細(xì)胞普查網(wǎng)絡(luò)（BICCN）的資助，這項(xiàng)計劃支持實(shí)驗(yàn)室繪制小鼠及包括人類在內(nèi)的靈長類腦的綜合圖譜。而三項(xiàng)研究都指向相似的結(jié)論：小鼠的腦在細(xì)胞多樣性上相當(dāng)復(fù)雜，這種復(fù)雜性更加體現(xiàn)在皮層外的其他部分。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)皮層中細(xì)胞的種類更少，不同種細(xì)胞所具有的轉(zhuǎn)錄特征差異性更大。而位于腦底部的下丘腦、中腦和后腦等區(qū)域則具有更多種類的細(xì)胞，且細(xì)胞間差異性更小。

曾紅葵推測這些差異源自這些區(qū)域不同的演化史。下丘腦、中腦和后腦等區(qū)域主要負(fù)責(zé)重要的生理功能，譬如進(jìn)食、代謝和運(yùn)動，這些功能在動物間是保守的，因此具有相對固定的細(xì)胞配置，長時間以來形成不再變化的高度特異細(xì)胞。但皮層則負(fù)責(zé)更高級的認(rèn)知功能，負(fù)責(zé)適應(yīng)環(huán)境變化，這些細(xì)胞出現(xiàn)差異化表現(xiàn)的頻率就會更高。

馬科斯科的數(shù)據(jù)目前公開發(fā)布在braincelldata.org，另外兩項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)則在brainimagelibrary.org；同時，莊小威表示艾倫研究所計劃2023年發(fā)布一個新的交互網(wǎng)站。

小腦切片的熒光顯微照片

“這些絕對稱得上美妙的研究，”卡羅林斯卡研究所的神經(jīng)科學(xué)家康斯坦丁諾斯·美萊迪斯（Konstantinos Meletis）評價道，“這些研究說明目前可以利用大規(guī)模靶向方法同時理解成百上千的基因的空間組織形式。”美萊迪斯和同事們在三年前發(fā)表了自己的小鼠全腦圖譜，他們用到了不同的空間轉(zhuǎn)錄組方法。（這項(xiàng)研究沒有在單細(xì)胞水平繪制全腦圖譜，但在特定區(qū)域內(nèi)說明了這項(xiàng)技術(shù)可以與單細(xì)胞RNA測序相結(jié)合以獲得細(xì)胞水平的分辨率）。

超越基因表達(dá)

“單細(xì)胞基因表達(dá)圖譜是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的無價之寶。”曾紅葵評價道。從分子特征角度準(zhǔn)確定位特定細(xì)胞種類后，神經(jīng)科學(xué)家便可以此開發(fā)工具研究健康腦中特定細(xì)胞的功能，并進(jìn)一步研究疾病狀態(tài)下的情況。

而研究者正繪制的圖譜可不止這一種。

加州大學(xué)圣地亞哥分校的分子遺傳學(xué)家任冰與加州拉荷亞索爾克研究所的分子生物學(xué)家喬·埃克（Joe Ecker）合作，繪制了小鼠腦的表觀遺傳學(xué)圖譜。埃克的實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一種檢測DNA甲基化（一種DNA上的化學(xué)修飾，能夠改變基因表達(dá)）的工具，適用于單個細(xì)胞的整個基因組，而任冰團(tuán)隊(duì)則設(shè)計了一種解析染色體可及區(qū)域的工具，能夠標(biāo)記活躍的基因表達(dá)和調(diào)控區(qū)域。“我們希望通過不同細(xì)胞類型中的甲基化情況，從另一角度定義細(xì)胞的身份，”任冰表示，“這種方法在鑒定不同腦細(xì)胞的同時，也能更綜合地理解每種細(xì)胞類型基因調(diào)控的機(jī)制。”

任冰和埃克將這些技術(shù)相結(jié)合，在小鼠腦中鑒定出了超過4 000種細(xì)胞簇。研究團(tuán)隊(duì)于四月在《生物學(xué)檔案》（ArchivesofBiologicalSciences）上發(fā)表了這項(xiàng)研究，報告了他們發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞種類與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的鑒定結(jié)果很相似。這項(xiàng)研究同樣是BICCN計劃的一部分。

與此同時，中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所的神經(jīng)科學(xué)家嚴(yán)軍和同事正在繪制腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞間的遠(yuǎn)程連接，即“投射組”圖譜。他們開發(fā)出一種計算機(jī)算法，在小鼠的前額葉皮層（在人類中對應(yīng)的腦區(qū)參與決策、情感和感知等功能）中通過追蹤軸突（將信號從神經(jīng)細(xì)胞胞體中傳遞出去的長纖維）的投射鑒定出這些神經(jīng)元連接。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將研究范圍擴(kuò)展到樹突（神經(jīng)細(xì)胞接受信號的枝干），并將全腦的投射組作為目標(biāo)。

“神經(jīng)系統(tǒng)是一個網(wǎng)絡(luò)，”嚴(yán)軍解釋說，“而網(wǎng)絡(luò)的功能取決于其連接性。”

還有一些科學(xué)家在這一領(lǐng)域耕耘已久。美國赫爾希賓夕法尼亞州立大學(xué)的神經(jīng)科學(xué)家金永洙（Yongsoo Kim）正利用高分辨率成像技術(shù)繪制小鼠腦從胚胎階段開始的發(fā)育全過程的3D圖譜。金永洙表示，目前只有一個成年小鼠腦的“極好的”參考圖譜——艾倫小鼠腦通用坐標(biāo)框架，該框架由1 600個鼠腦的高分辨率圖像制成。但這一圖譜也只代表某個單一的時間點(diǎn)。金永洙團(tuán)隊(duì)希望通過繪制更加通用的坐標(biāo)框架，為繪制不同發(fā)育階段的小鼠腦圖譜提供模板。

從小鼠到人

目前，研究人員正將這些技術(shù)用于更大型的哺乳動物，包括人類。NIH 2022年宣布投入5億美元資助腦計劃細(xì)胞圖譜網(wǎng)絡(luò)（BICAN），以建立更加綜合的人腦圖譜。

但繪制人腦圖譜的挑戰(zhàn)更大：一方面，人腦相對于小鼠腦的細(xì)胞數(shù)量估計要多上千倍。同時，科學(xué)家處理人腦組織的實(shí)驗(yàn)手段也有限——組織樣本必須來自尸腦樣本，同時人類樣本相比實(shí)驗(yàn)小鼠的異質(zhì)性更大，實(shí)驗(yàn)小鼠往往具有一致的遺傳背景，飼養(yǎng)環(huán)境也類似。

盡管如此，人腦研究已經(jīng)帶來了新發(fā)現(xiàn)。林納爾松和同事在一項(xiàng)分析中利用單核RNA測序調(diào)查人腦中300萬個細(xì)胞。研究結(jié)果于2022年10月在《生物學(xué)檔案》中上線，他們發(fā)現(xiàn)人腦的中腦和后腦等區(qū)域中細(xì)胞種類相對于皮層更多，這與小鼠中發(fā)現(xiàn)的一致。“我們在人類中往往采取一種皮層為中心的觀點(diǎn)。”林納爾松評價道，但這些發(fā)現(xiàn)提示研究者應(yīng)該更加重視其他常被忽略的腦區(qū)。

與此同時，研究者繼續(xù)深入研究空間細(xì)胞圖譜，探索這些新鑒定得到的細(xì)胞種類的功能。譬如莊小威團(tuán)隊(duì)，正在探究不同細(xì)胞種類的空間臨近關(guān)系以及它們的基因表達(dá)模式，以推斷細(xì)胞間的交互作用，這能夠?yàn)槠饰龈鞣N腦功能的分子和細(xì)胞機(jī)制提供重要的線索。同時馬科斯科表示他的團(tuán)隊(duì)正在開發(fā)一種算法，用于決定區(qū)分細(xì)胞種類所需基因數(shù)的最小值——猶如是給神經(jīng)科學(xué)家一本實(shí)驗(yàn)用的“食譜”。

研究者甚至可以通過挖掘這些圖譜的數(shù)據(jù)開發(fā)療法。目前精神和神經(jīng)疾病的治療方法傾向于使用粗略的細(xì)胞分類方法——例如靶向多巴胺能或血清素能神經(jīng)元。但上述的圖譜提示我們腦中細(xì)胞有上千種，其中或許就隱藏著調(diào)控人類行為的全新方法。“從治療的角度來看，”馬科斯科說，“我們在這一領(lǐng)域中有很大的機(jī)會研究發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)胞種類如何影響認(rèn)知、情緒，以及其他的生理學(xué)機(jī)制。”

資料來源Nature