抑制TRAF6的E3泛素連接酶活性減輕野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠肺血管重構*

許正秋， 邱莉華， 陳 睿， 馬 倩， 李冰冰

（南京中醫藥大學附屬鼓樓臨床醫學院麻醉科，江蘇 南京 210008）

肺動脈高壓（pulmonary hypertension， PH）是一類嚴重影響人類生活質量的心血管疾病，表現為肺血管重塑和肺血管后負荷進行性升高，嚴重時引起患者右心功能衰竭甚至死亡［1］。肺動脈平滑肌細胞過度增殖和凋亡抵抗導致肺小動脈中膜增厚甚至閉塞是PH 的主要病理機制之一［2-3］。盡管目前臨床上使用的血管擴張藥物主要包括前列環素類似物和前列環素受體激動劑、內皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶-5 抑制劑和可溶性鳥苷酸環化酶抑制劑等藥物在一定程度上對PH 患者的癥狀有緩解作用［4］，但對于改善患者的遠期生存率效果不佳，仍需要進一步探討PH 的血管重塑機制，為靶向治療提供新的策略。腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6， TRAF6）是一種能夠介導蛋白間相互作用的適配蛋白以及免疫調節受體家族的下游因子［5］，有研究報道發現其N 端的RING 結構域具有E3 泛素連接酶的活性，能夠介導其自身在內的多種蛋白質的多聚泛素化以及信號轉導［6］。信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）是一類細胞信號轉錄因子，有研究表明磷酸化的STAT3能促進肺動脈平滑肌細胞的增殖與凋亡抵抗，導致PH 的發生［7］；研究發現在荷瘤小鼠模型中，來源于腫瘤組織的髓源性抑制細 胞（myeloid-derived suppressor cells， MDSCs）中TRAF6 的表達顯著上調，且TRAF6 能夠與STAT3 結合，介導STAT3 的K63 連接的多聚泛素化及STAT3的磷酸化激活來調節MDSCs 的免疫抑制活性，促進腫瘤的發展［8］。但在PH 中TRAF6 的E3 泛素連接酶活性是否對STAT3的磷酸化激活至關重要目前還不清楚。因此，本研究探討了PH中TRAF6的泛素連接酶活性對STAT3激活和肺血管重構的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與試劑

雄性SD大鼠42只，6~8周齡，質量為180~220 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司［實驗動物許可證號：SYXK（蘇）2021-0007］。維持環境溫度20~21 ℃，濕度50%~60%，動物采用普通飼料喂養，自由飲食。本研究所有的動物相關操作均按照動物實驗倫理的規定進行。野百合堿（monocrotaline， MCT）為Sigma 產品；C25-140（TRAF6 特異性E3 泛素連接酶活性抑制劑）購自MedChemExpress；抗TRAF6 抗體（ab33915）為Abcam 產品；抗STAT3 抗體（4904T）及抗p-STAT3 抗體（9145T）為Cell Signaling Technology產品；抗細胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體及抗β-actin 抗體為Proteintech 產品；抗K63 ubiquitin 抗體為Cell Signaling Technology 產品。免疫共沉淀試劑盒（2179S）購自上海碧云天生物技術有限公司。

2 動物分組及處理

在飼養環境適應1 周后，將42 只SD 大鼠隨機分為4 組：對照（control， CON）組，C25-140 組，MCT 組及MCT+C25-140 組。MCT 組及MCT+C25-140 組的大鼠均先在頸后皮下單次注射野百合堿，濃度為2%，劑量為60 mg/kg，建立PH 模型。C25-140 組及MCT+C25-140組大鼠于造模后第14天、21天和28天腹腔注射劑量為9.8 mg/kg的C25-140化合物。

3 實驗方法

3.1 超聲心動圖檢測 大鼠吸入異氟烷麻醉，體動反應消失后仰臥固定于鼠板，固定呼吸面罩，以500 mL/min流量的異氟烷維持，去除胸前毛發，將耦合劑涂抹于超聲探頭，準備超聲檢測。脈沖多普勒模式測量肺動脈血流加速時間（pulmonary arterial acceleration time， PAAT），在心尖四腔切面使用M 超測量三尖瓣環平面收縮期位移（tricuspid annular plane systolic excursion， TAPSE）。

3.2 肺組織取材 大鼠安樂死后，暴露出雙肺和心臟，剪開左心耳，經左心室用肝素生理鹽水對肺循環持續進行灌注，直至雙肺顏色轉白停止灌注。取右肺部分置于-80 ℃保存，左肺用4%多聚甲醛固定24 h，用于之后的病理學染色。

3.3 大鼠原代肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs）分離培養 大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后，浸泡于75%乙醇5 min，于無菌手術臺上開胸取出肺組織，無菌PBS 沖洗3 次。顯微鏡下分離出肺動脈，剔除血管周圍肺組織、神經及筋膜等，分離干凈的血管轉移至新10 cm 培養皿中。縱行剪開肺血管，用鑷子輕輕刮拭內層，去除內皮細胞層。用眼科剪剪成約1 mm×1 mm×1 mm 的小塊，接種到含1 mL DMEM 培養基（含20%血清、100 U/mL 雙抗）的平皿中，輕搖培養基，使每塊組織塊間間距約為0.8~1.0 cm。靜置于37 ℃、5% CO2培養箱中2 h，待組織貼牢后，緩慢添加DMEM 培養基（含20%血清、100 U/mL 雙抗）完全覆蓋組織塊，繼續培養至細胞從組織塊周圍爬出。

3.4 HE 染色 將固定好的大鼠肺組織進行脫水、石蠟包埋，切成5 μm 厚的切片，用蘇木精和伊紅進行染色，在400倍鏡下觀察各組管徑20~150 μm的肺中小動脈形態，使用Image-Pro Plus 6.0 測量肺小動脈中膜厚度（media thickness， MT）和血管外徑（external diameter， ED），計算肺小動脈中膜厚度百分比（中膜厚度百分比=2MT/ED×100%）。

3.5 Western blot 稱取50~100 mg 的新鮮肺組織，用預冷的PBS 清洗，去除多余水分后加入含磷酸酶和蛋白酶抑制劑的裂解液，剪碎組織后勻漿，冰上靜置30 min，離心后取上清，BCA 法測定蛋白濃度。使用相應濃度的SDS-PAGE 進行蛋白分離、轉膜、封閉，加Ⅰ抗（TRAF6和cyclin D1抗體，1∶5 000；STAT3和p-STAT3 抗體，1∶2 000；β-actin 抗體，1∶10 000），置于4 ℃搖床上孵育過夜。TBST 洗膜3 次，加入相應的HRP 標記的Ⅱ抗，室溫下孵育1.5 h，TBST 再次洗滌后進行曝光，留取圖片，使用ImageJ 分析條帶的灰度值，以目的條帶和內參條帶的灰度值之比反應目的蛋白的表達水平。

3.6 免疫共沉淀 取CON 組及PH 組大鼠PASMCs各一皿，棄培養基，PBS 清洗后加入含磷酸酶和蛋白酶抑制劑的裂解液，用細胞刮將細胞刮下并轉移至1.5 mL 離心管中，冰上裂解30 min，離心后取上清，BCA 法測定蛋白濃度。取適量CON 組和PH 組細胞蛋白上清液，加入STAT3抗體工作液（稀釋度1∶200）和IgG 工作液，置于側擺搖床，4 ℃孵育過夜。采用免疫共沉淀法測定STAT3 的K63 泛素化水平。將免疫沉淀后的上清使用相應濃度的SDS-PAGE 進行分離、轉膜、封閉，加Ⅰ抗K63 ubiquitin 抗體（稀釋度1∶1 000），4 ℃搖床孵育過夜。TBST 洗膜3 次，加入相應的HRP 標記的Ⅱ抗，室溫下孵育1.5 h，TBST 再次洗滌后進行曝光，留取圖片。

3.7 免疫熒光染色 新鮮取材的肺組織用OCT進行包埋，切成7 μm 的厚度。用0.5% Triton X-100 溶液進行通透，PBS 洗滌3 次。5% BSA 溶液室溫封閉35 min。甩去封閉液，加入適量TRAF6（稀釋度1∶50）和STAT3（稀釋度1∶1 000）的Ⅰ抗混合液，4 ℃過夜。孵育相應的Ⅱ抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗后，加DAPI（含抗熒光淬滅劑）封片。熒光顯微鏡下觀察肺中小動脈中目標蛋白的定位和表達，拍照并存圖。

4 統計學處理

采用GraphPad Prism 9 軟件進行分析處理，正態分布的計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，配對樣本采用t檢驗，多個樣本比較時采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 腹腔注射C25-140對PH大鼠肺血管重構的影響

與CON 組比較，MCT 組大鼠PAAT 和TAPSE 明顯縮短（P<0.05），中小肺動脈中膜明顯增厚（P<0.05），α-SMA 熒光強度明顯增強（P<0.05）；MCT+C25-140組大鼠PAAT 和TAPSE 相對MCT 組增加，肺中小動脈中膜增厚程度減小（P<0.05），α-SMA 熒光強度降低（P<0.05），見圖1和2。

Figure1.Comparison of PAAT， TAPSE and related indexes of vascular remodeling in rats before and after modeling.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs CON group； &&P<0.01 vs MCT group.圖1 造模前后大鼠PAAT、TAPSE及血管重構相關指標的比較

Figture 2.HE staining and α-SMA immunofluorescence of small pulmonary vessels in rats （scale bar=50 μm）.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs CON group； &P<0.05 vs MCT group.圖2 大鼠肺組織HE染色和α-SMA免疫熒光結果

2 PH大鼠PASMCs中STAT3的K63泛素化情況

與CON 組PASMCs 比 較，PH 大 鼠PASMCs 中STAT3的K63泛素化水平明顯升高，見圖3。

Figure 3.K63 ubiquitin level of STAT3 in pulmonary artery smooth muscle cells.圖3 肺動脈平滑肌細胞中STAT3的K63泛素化情況

3 腹腔注射C25-140 對PH 大鼠肺組織TRAF6 表達、STAT3磷酸化及cyclin D1表達的影響

與CON 組比較，MCT 組大鼠肺組織TRAF6 蛋白水平、p-STAT3/STAT3 比值及cyclin D1 蛋白水平明顯升高（P<0.05），而MCT+C25-140 組大鼠肺組織中TRAF6 蛋白水平、p-STAT3/STAT3 比值及cyclin D1蛋白水平相對于MCT 組有所降低（P<0.05），見圖4。

Figure 4.The protein expression of TRAF6， STAT3， p-STAT3 and cyclin D1 in each group.Mean±SD.n=6.*P<0.05， **P<0.01 vs CON group； &P<0.05， &&P<0.01 vs MCT group.圖4 肺組織TRAF6、STAT3、p-STAT3及cyclin D1的表達

4 腹腔注射C25-140 對PH 大鼠肺組織TRAF6 與STAT3共定位影響

與CON 組相比，MCT 組大鼠肺血管中膜TRAF6和STAT3 存在共定位，經C25-140 處理以后，兩者的共定位明顯減弱，見圖5。

Figure 5.Immunofluorescence of TRAF6 and STAT3 in lung tissue of rats in each group （scale bar=50 μm）.圖5 肺血管TRAF6與STAT3的共定位情況

討 論

PH 是一種嚴重的心血管疾病，被稱為心血管系統中的癌癥，其主要病理特征是肺動脈中膜平滑肌細胞的異常增殖，內膜和外膜的纖維化，原位血栓形成、叢狀病變以及周圍血管炎癥浸潤，引起肺動脈持續性異常收縮，肺血管阻力和肺動脈壓升高，最終導致右心衰竭甚至死亡［9］。在本研究中，采用單次皮下注射野百合堿的方式構建大鼠PH 模型，造模后PH 大鼠PAAT 和TAPSE 明顯縮短，中小肺動脈中膜厚度明顯增加，α-SMA 熒光強度明顯增加，提示造模成功。

TRAF6 是一種具有E3 泛素連接酶活性和免疫調節雙重作用的蛋白，已有研究表明TRAF6 在結腸癌、乳腺癌、肺癌以及胰腺癌等多種惡性腫瘤中均存在異常表達，并參與腫瘤細胞的增殖、轉移及血管生成等過程［10-13］。本研究發現MCT 誘導的PH 大鼠肺組織中TRAF6 也存在明顯升高，通過使用化合物C25-140 抑制TRAF6 的泛素連接酶活性后，TRAF6的蛋白水平有所下降，可能是由于TRAF6 泛素連接酶活性受到抑制時，功能失活的TRAF6 自身穩定性有所降低，繼而被降解，但具體的降解機制還需要進一步的探究。STAT3 是一種細胞信號轉錄因子，參與正常細胞的分化、增殖和血管生成等多種生命活動［14］。STAT3 靜息狀態下通常以非活性狀態定位于細胞的胞質當中，磷酸化是STAT3激活的重要步驟，STAT3 一旦被激活即轉移到細胞核當中，充當多種靶基因的轉錄激活劑［15-16］。早在2012年，Wei等［17］就通過免疫共沉淀實驗證明在哺乳動物細胞中E3 泛素連接酶TRAF6 能夠與STAT3 結合，負調控TAK2-STAT3 信號通路的激活，下調STAT3 下游的靶基因CRP 和ACT 的表達；另外，Ruan 等［18］的研究證實了鼠沙門氏桿菌感染宿主細胞時可以特異性誘導TRAF6 發生泛素化，隨后TRAF6 在STAT3 的SH2 結構域介導K63 連接的泛素化，促使STAT3 被招募到細胞膜，發生磷酸化激活，以利于沙門氏桿菌在宿主細胞內生長繁殖。在本研究當中，在TRAF6的E3泛素連接酶活性受到抑制時，STAT3 的磷酸化水平明顯降低，且免疫熒光共定位的結果也顯示抑制TRAF6 的泛素連接酶活性時肺動脈上STAT3 與TRAF6 的共定位情況明顯減弱。由此可見，通過抑制TRAF6 的E3 泛素連接酶活性，可能影響TRAF6與STAT3 的相互結合，從而影響STAT3 的磷酸化激活過程。

cyclin D1 是一種細胞周期調節蛋白，在有絲分裂的G1期向S 期轉變的過程中發揮關鍵調節作用，是細胞增殖的關鍵靶點［19］。多項研究表明cyclin D1是STAT3 下游靶點，能夠被 STAT3 直接調控。Deng等［20］發現在腸上皮細胞中STAT3 能夠調節下游cyclin D1 的表達，促進腸上皮細胞的增殖。另外Zhou等［21］發現血管平滑肌細胞當中STAT3 也能夠直接靶向下游的cyclin D1，促進血管平滑肌細胞的增殖與遷移。cyclin D1 的過表達與PH 發病密切相關，Zhu等［22］發現在PH 發病過程中，血小板衍生生長因子能夠誘導肺動脈平滑肌細胞中cyclin D1 的過表達，引起PASMCs增殖。類似地，Xiao等［23］發現在缺氧誘導的PH 大鼠肺動脈平滑肌細胞當中cyclin D1 明顯過表達。在本研究中，當抑制TRAF6 的泛素連接酶活性時，STAT3 的磷酸化水平下降，下游的cyclin D1 水平也隨之改變，故PH 疾病當中TRAF6-STAT3-cyclin D1信號通路激活并調控肺動脈平滑肌細胞的增殖。

綜上所述，TRAF6 分子上調介導STAT3 泛素化后磷酸化激活，磷酸化的STAT3隨后激活下游cyclin D1 等細胞周期因子的轉錄，導致肺動脈平滑肌細胞增殖與凋亡抵抗，肺動脈中膜增厚，肺血管重構。當抑制TRAF6 的泛素連接酶活性時，STAT3 的磷酸化水平降低，抑制STAT3與TRAF6相互作用，最終可降低大鼠肺動脈壓力、增強右心的收縮力和緩解肺血管中膜增厚，故TRAF6作為一種E3泛素連接酶直接介導STAT3 泛素化后磷酸化激活的機制可能在PH的發病過程中發揮重要作用。