飲食模式對大鼠糖尿病早期腎臟病變的影響及其機制*

李 明， 馮珊珊， 金 毅， 黃寶明， 賀碧霞， 李 玉， 薛有安，王汝仙， 謝泳嬌， 王 茜， 李 靜△

［1廣東東陽光藥業股份有限公司，抗感染新藥研發國家重點實驗室，廣東 東莞 523871；2深圳市藥品檢驗研究院（深圳市醫療器械檢測中心），廣東省藥監局實驗病理學重點實驗室，廣東 深圳 518057］

糖尿病是一種復雜的疾病，雖然已有多種治療手段針對其發病機制和各環節，但新的治療靶點如葡萄糖激酶、G 蛋白偶聯受體、頂膜鈉依賴性膽鹽轉運體等仍在不斷開發中［1-2］。腎臟病變是常見的糖尿病慢性微血管并發癥，約占糖尿病血管并發癥患者的40%，也是終末期腎病的主要原因［3-4］。高血糖首先引起腎臟適應性高濾過率，進而導致腎臟細胞代償性增生、炎癥以及纖維化等腎臟病變［5-6］。其發生和進展不僅與腎素-血管緊張素-醛固酮系統的激活相關，還與足細胞損傷、丟失和線粒體功能障礙，腎小球內皮細胞損傷和功能障礙，氧化應激以及炎癥介質相關，也受遺傳和環境等因素的影響［7-8］。臨床上通常使用包括藥物治療和飲食調控等在內的多因素治療［9］。

目前有多種飲食調控模式，如控制飲食中某一類成分（碳水化合物、蛋白質、鹽分等）的飲食模式、地域文化的飲食類型（地中海飲食、中式飲食等）、特殊調控營養的飲食類型（生酮飲食、得舒飲食等）、調整規律的飲食模式（間歇性禁食等）等。各種飲食調控對于諸如糖尿病、高血壓、高尿酸血癥和阿爾茨海默病等慢性疾病的影響有相當多的文獻報道［10-12］。飲食限制是其中最簡單的飲食模式，通常指相比自由攝食整體減少食物攝入一定百分比且不造成營養不良的一種飲食模式［13］，類似于中國傳統文化中“七分飽”。限制飲食的攝入量能降低機體的氧化應激，減緩慢性炎癥的發生發展［14］，但其在糖尿病等代謝性疾病中作用及機制尚不明確。

疾病病因或發病機制的研究方法中，代謝組學作為一種有效工具在糖尿病研究中獲得越來越多的應用，如尋找糖尿病及其并發癥患者與正常機體間不同的代謝產物或代謝圖譜［15-17］。動物疾病模型也是研究疾病發病機制的重要手段，以往大鼠糖尿病模型通常使用較高劑量（總劑量≥40 mg/kg）的鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）單獨誘導或聯合單側腎切除、高糖高脂飲食誘導等［18-20］，但動物死亡率較高且病變較嚴重，不適用于研究糖尿病早期腎臟病變。因此，本研究設置誘導糖尿病及其腎臟病變的高脂飲食組和可能具有干預作用的控制飲食組，給予單次低劑量（15 mg/kg）STZ 建立大鼠模型［17］，結合腎臟組織病理學和代謝組學，比較飲食模式差異對大鼠糖尿病早期腎臟病變的影響，并嘗試尋找可能的作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠147 只，體重180~220 g，6 周齡，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002］。動物飼養于廣東東陽光藥業股份有限公司東陽光研究院屏障環境動物實驗室［使用許可證號：SYXK（粵）2014-0135； SYXK（粵）2019-0135］，溫度20~26 ℃，濕度40%~70%，12 h/12 h 晝夜交替照明。本研究經廣東東陽光藥業股份有限公司東陽光實驗動物倫理委員會審核批準。

2 主要試劑和儀器

STZ（V900890）購自Sigma-Aldrich；血糖檢測試劑盒（19343601）和cobas c311 型全自動生化分析儀購自Roche；DM3000+DFC290+Q 型顯微圖像采集工作站（Leica）；1260 HPLC-6530 Accurate Mass Q-TOF液相色譜四極桿飛行時間質譜聯用系統（Agilent）。

3 主要方法

3.1 動物分組與造模 SD 大鼠購入后經檢疫適應期，隨機分入正常飲食組（自由攝食維持飼料）、控制飲食組［13-14］（維持飼料但為正常飲食組前1 周實際攝食量的80%，探索性設定）和高脂飲食組［18-20］（自由攝食高脂飼料），均自由飲水。維持飼料和高脂飼料（蛋白質19.5%，脂肪17.3%，灰分3.2%，粗纖維1.5%）由廣東省醫學實驗動物中心配制。其中正常飲食組和控制飲食組各25 只，而高脂飲食組由于考慮到如下3 個因素，增加了入組數量：（1）可能出現成模率降低及死亡；（2）腎臟病變可能較輕和（或）不確定性大；（3）保留根據病變程度在組內再分組的可能性（腎小管病變程度分組的研究結果已發表［17］），入組了97 只大鼠以保證有充足的動物開展研究。動物喂養70 d 后，一次性腹腔注射STZ 15 mg/kg（用pH 4.2~4.5的檸檬酸緩沖液按1%濃度新鮮配制，注射前動物禁食不禁水14 h）［17-20］。在注射后1 周時（誘導前期）各組取部分動物做病理檢查，其余動物繼續喂養至第130天（誘導后期）。

3.2 樣本采集 STZ 注射前后，在提前設定的時點分別檢測體重、攝食量、飲水量并通過尾靜脈采血。STZ注射后1周和第130天分別對各組的部分動物實施安樂死，取腎臟，將左腎去除包膜并沿縱軸方向切開，固定在4%多聚甲醛液。

3.3 血糖檢測 將尾靜脈采集的血樣制備血清，通過全自動生化檢測儀測定血糖濃度，以注射STZ 后1周的空腹血糖≥11.1 mmol/L為造模成功標準［20］。

3.4 腎臟病理形態學分析 從固定好的大鼠腎臟取材，經脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色、脫水及封片，顯微鏡下觀察，并將存在病理形態學變化的樣本記為“腎臟病理陽性”。

3.5 代謝組學樣品處理及分析 將采集的大鼠血樣制備成血漿樣品，取100 μL 血漿加入300 μL 甲醇-乙腈（1∶1），再加入10 μL 內標工作液，渦旋5 min混勻后于18 000×g離心5 min。取200 μL 上清加入96 孔板，使用高效液相色譜四極桿飛行時間質譜聯用系統分析，液相和質譜具體條件可參考文獻［17］。使用m/z=1 700 以下的信號進行分析，質譜數據經MassHunter 和XCMS online 處理及校正，并使用Metaboanalyst 4.0 建模分析，具體的數據分析步驟可參考相關文獻［21-22］，主要使用京都基因與基因組百科全 書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析代謝通路。

4 統計學分析

統計學分析應用SPSS 16.0軟件處理，除另作說明外，數據用均數±標準差（mean±SD）表示。首先用Levene 檢驗評估正態分布，正態分布數據進行單因素方差分析檢驗，非正態分布數據則對對數轉換后的數據進行Dunnett 多重比較。代謝組學數據在進行模型分析后使用Prism 7.0 軟件中雙因素方差分析進行統計學分析。

結 果

1 STZ誘導前后各組大鼠的基本狀態比較

STZ 誘導前后各組大鼠的基本狀態比較見圖1。相比正常飲食組，注射STZ 前控制飲食組體重增長率降低（P<0.05），高脂飲食組體重增長率升高（P<0.05）；注射STZ 后控制飲食組體重增長率無顯著差異，高脂飲食組體重增長率顯著下降（P<0.01）。注射STZ 前后各組大鼠的攝食量均無顯著差異而飲水量均較注射前略微升高（P>0.05）。此外，相比正常飲食組，注射STZ 前高脂飲食組飲水量降低（P<0.05），而注射STZ 后飲水量則顯著增加（P<0.05），控制飲食組在注射后飲水量略低但無顯著差異。

Figure 1.The body weight， food intake and water intake of the rats in each diet group before and after STZ induction.A： body weight change rate； B： food intake； C： water intake.In B and C， the unit in X-axis is phase （1 phase = 3 days）， and the day of STZ injection （Day 70） is recorded as phase 0.圖1 STZ誘導前后各飲食組大鼠的體重、攝食量和飲水量

2 STZ 誘導各組大鼠糖尿病發生率和腎臟病變比較

各組大鼠空腹血糖濃度和糖尿病造模成功率見圖2A、C。其中正常飲食組、控制飲食組和高脂飲食組中的未成模大鼠空腹血糖均值分別為5.9、8.5 和8.0 mmol/L（P>0.05），成模大鼠空腹血糖均值分別為18.8、18.4 和19.4 mmol/L（P>0.05），未成模與成模動物之間差異顯著（P<0.01）。控制飲食組糖尿病造模成功率為48.0%，高于正常飲食組的16.0%而低于高脂飲食組的89.2%。

Figure 2.The summary of diabetes modeling and rat renal lesions in each diet group after STZ induction.A： the blood glucose concentration at Day 77 （1 week after STZ injection； the animal numbers are labelled in the legend； mean±SD； P<0.01 between non-diabetic rats and diabetic rats）； B： the renal lesion positive rate examined at Day 77 and Day 130 （the ratio of animal number of renal lesion+ to total animal number in each group is marked at the top of each bar； N/A indicates no animal available）； C： comparisons of percentage of diabetes modeled， percentage of renal lesion+ and their ratio （the animal numbers are labelled in the center of each pie chart and the corresponding percentages are in bold）.Fourteen rats in highfat diet group were euthanatized for tissue sample collection before Day 77； to inspect the renal pathological changes， 12，12 and 19 rats were sacrificed from regular diet group， controlled diet group and high-fat diet group， respectively； another 5 rats in high-fat diet group were dissected to collect tissue samples at other time points.圖2 STZ誘導后各飲食組大鼠的糖尿病成模及腎臟病變程度的匯總

各組大鼠腎臟病理檢查后匯總的腎臟病變率見圖2B、C。病理檢查顯示：在STZ 誘導后1 周，各組的糖尿病未成模大鼠均無腎臟病變，部分成模大鼠可見腎小管空泡變性，主要累及部分遠曲小管和近曲小管，少量腎小球輕微毛細血管擴張。控制飲食組成模大鼠未見該病變（0/4），而高脂飲食組成模大鼠病變比例為7/10（圖3）。在第130 天，僅正常飲食組和控制飲食組留存有未成模大鼠，其腎臟病變比例分別為5/13 和0/5；控制飲食組和高脂飲食組成模大鼠的腎臟病變比例分別為3/8 和57/59（圖4）。腎臟病變陽性率在控制飲食組為23.1%，低于正常飲食組的38.5%和高脂飲食組的96.6%。

Figure 3.Representative renal histopathological images from the rats after STZ induction for 1 week （HE staining， scale bar=200μm； arrow indicates vacuolar degeneration of renal tubule）.A： renal lesion- from a diabetic rat in controlled diet group；B： renal lesion+ from a diabetic rat in regular diet group； C： renal lesion+ from a diabetic rat in high-fat diet group.圖3 STZ誘導1周后的代表性大鼠腎臟組織病理圖片

3 STZ誘導大鼠血漿代謝組學分析

3.1 主 成 分 分 析（principal component analysis，PCA） 采用與本實驗同期、正常飲食喂養且未注射STZ的其他大鼠的血漿樣品做為陰性對照，使用PCA分析各飲食組血漿代謝組學數據（圖5）。注射STZ前及注射STZ 后的1周、3周和5周，各組動物的代謝產物持續變化。注射STZ 前，PCA 得分圖上沒有任何兩組完全分離，血漿代謝產物的差異不顯著；注射STZ后，高脂飲食組在模型平面上與陰性對照組顯著保持分離；而控制飲食組與正常飲食組在造模后期血漿代謝產物特征均恢復至陰性對照組水平。

Figure 5.Principal component analysis of plasma metabolic profiles from the rats in each diet group.A： before STZ induction； B， C and D： 1 week， 3 weeks and 5 weeks after STZ induction， respectively.圖5 各飲食組大鼠血漿代謝譜的主成分分析

由于正常飲食組與控制飲食組間有重疊，將這兩組數據單獨比對分析，以便更直觀對比血漿代謝產物特征（圖6）：STZ 注射前，兩組樣本高度重疊，在注射1 周后分離最顯著，5 周后基本再次重疊，說明兩組的代謝產物及病變程度差異主要是對STZ 的耐受性不同導致。

Figure 6.Principal component analysis of plasma metabolic profiles from the rats in regular diet group and controlled diet group.A：before STZ induction； B， C and D： 1 week， 3 weeks and 5 weeks after STZ induction， respectively.圖6 控制飲食組和正常飲食組大鼠血漿代謝譜的主成分分析

3.2 正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA） 控制飲食組和正常飲食組注射STZ 后第1 周的代謝產物在PCA 平面已經基本分離，但在95%置信限仍然有小范圍的重疊，為了使兩組數據完全分離后進行重要代謝產物篩選，對第1 周兩組數據進行OPLS-DA，結果顯示兩組數據能完全分離并篩選出18 個對模型貢獻最大的代謝產物（圖7），兩組之間關鍵的差異性代謝產物及變化趨勢見表1，其中控制飲食組L-肉毒堿（L-carnitine）、不飽和脂肪酸二十四碳四烯酸（24：4n-6）［tetracosatetraenoic acid（24：4n-6）］和有機酸1-甲基尿酸（1-methyluric acid）分別升高了94.8%（P<0.05）、269.9%（P<0.01）和38.0%（P<0.01），氨基酸衍生物L-胱硫醚（L-cystathionine）和4-氯-L-蘇氨酸（4-chloro-L-threonine）在正常飲食組中分別增加165.9%（P<0.05）和233.0%（P<0.05），而氨基酸L-酪氨酸（L-tyrosine）減少99.2%（P<0.05）。

表1 控制飲食組及正常飲食組組間的關鍵差異性大鼠血漿代謝產物Table 1.The key differential metabolites in rat plasma between regular diet group and controlled diet group （n=25）

Figure 7.Changes of key differential metabolites in rat plasma between regular diet group and controlled diet group.Dot indicates the mean relative level of one metabolite［relative to that in negative control group （set as 1）］；line indicates the change trend of one metabolite between regular diet group and controlled diet group.n=25.*P<0.05 vs regular diet group.圖7 控制飲食組與正常飲食組間的大鼠血漿關鍵代謝產物變化圖

討 論

本研究中，大鼠糖尿病造模成功率和組織病理結果表明，高脂飲食在糖尿病及腎臟病變具有重要作用，而在飲食結構相同時，控制攝入量比飽食可減輕大鼠糖尿病引發腎臟病變。正常飲食組和控制飲食組的代謝組學和腎臟病理結果提示，兩組的代謝產物差異主要見于STZ誘導后第1周，該階段的差異可能與兩組的腎臟病變差異有關。這可能是由于大鼠胰島受損并出現糖尿病癥狀時，高脂飲食可維持糖尿病癥狀繼而使腎臟病變的發生率高，而控制飲食則可有效干預并降低大鼠糖尿病引發腎臟病變的發生率。因此，本研究結果提示在胰島受損時，飲食結構和飲食量是影響機體應答反應的2 個關鍵因素，而控制飲食可減輕大鼠糖尿病腎臟病變。

L-肉毒堿和二十四碳四烯酸（24：4n-6）在控制飲食組中顯著升高，前者是三羧酸循環的核心，調控通過肉毒堿棕櫚酰轉移酶從線粒體外部獲得乙酰基并形成乙酰肉毒堿的關鍵環節［KEGG map04714 （thermogenesis）； https：//www.kegg.jp/entry/map04714］［23］，而后者除參與上述環節外，也參與解偶聯蛋白1 利用游離脂肪酸從三羧酸循環的電子轉移鏈獲得質子這個三羧酸循環產熱環節的終端。因此，從三羧酸循環不同環節涉及的關鍵物質肉毒堿及游離脂肪酸看，控制飲食可促進大鼠的能量代謝。

大鼠血漿中有機酸1-甲基尿酸和3 個氨基酸及其衍生物水平有顯著改變，提示控制飲食對大鼠腎臟病變的保護機制還可能涉及促進氨基酸的糖異生過程。1-甲基尿酸在長期缺乏食物導致體脂嚴重下降的大鼠中顯著上升，并刺激動物的進食及糖異生，以維持血中葡萄糖、三酰甘油等能量物質水平［24］。因此，控制飲食組1-甲基尿酸的升高是機體在刺激糖異生以維持正常血糖、血脂水平的重要信號物質。本研究中控制飲食組糖尿病成模比例高于正常飲食組，也可能與控制飲食大鼠糖異生作用更強有關。糖尿病中氨基酸水平通常沒有固定的變化模式，僅支鏈氨基酸有普遍的升高現象［25］，而L-酪氨酸主要與是否患糖尿病相關，與攝入的蛋白量關系不大［26］。本研究中控制飲食組與正常飲食組間攝入蛋白量的變化無法匹配體內的氨基酸變化幅度，而糖尿病中氨基酸糖異生會顯著增加［27］，故推測除氨基酸衍生物的增加可能導致氨基酸含量下降外，L-酪氨酸減少也可能與氨基酸糖異生有關。

控制飲食組大鼠血漿中肉毒堿、不飽和脂肪酸和部分氨基酸水平的變化也可能涉及其他腎臟保護機制。肉毒堿具有抗炎和抗氧化特性，通過參與長鏈脂肪酸的β-氧化而影響脂質代謝，并可改善胰島素敏感性、蛋白質營養和血脂異常，補充肉毒堿可被用于糖尿病的輔助治療［28］。不飽和脂肪酸可預防飽和脂肪酸引起的脂肪毒性（如胰島素抵抗和足細胞死亡），如等摩爾棕櫚酸和油酸的組合不會導致足細胞死亡［29］。控制飲食組大鼠血漿氨基酸水平降低一定程度上與限制飲食后蛋白質攝入減少有關，而低蛋白飲食也有利于控制糖尿病腎臟病變的進展［9，11］。故本研究中控制飲食組大鼠的腎臟病變減輕還可能涉及多方面的機制和通路，有待進一步研究。

綜上所述，本研究通過體重、攝食量、飲水量、組織病理和代謝組學等方法比較研究了不同飲食模式對STZ 誘導的大鼠糖尿病腎臟病變的影響。上述結果提示，高脂飲食可促進大鼠糖尿病及其腎臟病變的發生和發展；而控制飲食可促進大鼠的能量代謝和糖異生作用，有利于減緩大鼠糖尿病早期腎臟病變的進展。