非對稱性二甲基精氨酸通過激活鐵死亡促進小鼠早期腎損傷*

占 玉， 王知源， 劉志華， 李曉媚

（廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院前沿醫(yī)學交叉研究中心，廣州市生物靶向診治重點實驗室，廣東高校生物靶向診治與康復重點實驗室，廣東 廣州 510700）

近年來，慢性腎病（chronic kidney disease， CKD）的發(fā)病率和死亡率逐年升高，根據(jù)近700 萬成人患者的數(shù)據(jù)分析顯示，全球腎病患病率約為13%［1］。CKD 的早期腎損傷表現(xiàn)為微量白蛋白尿、腎小球腫大、腎小球系膜擴張、腎小球濾過率降低和炎癥反應等，并逐漸發(fā)展為進行性腎功能減退和腎臟纖維化，最終形成終末期腎病［2］，給患者和社會帶來沉重的負擔，需進一步研究CKD的早期腎損傷機制。

鐵死亡（ferroptosis）是指在二價鐵或酯氧合酶的作用下，催化細胞膜上高表達的不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質(zhì)過氧化而誘導細胞死亡，還表現(xiàn)為谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）的蛋白表達降低。有研究顯示，與對照組相比，糖尿病腎病和急性腎損傷模型小鼠的腎組織GPX4 蛋白均顯著減少、組織鐵蓄積，而通過抑制鐵死亡可顯著改善糖尿病腎病的腎臟肥大和蛋白尿增多等病理損傷，并提高小鼠存活率［3-5］，但在CKD 中鐵死亡通路激活的上游因素尚未清楚。

鐵死亡主要由鐵穩(wěn)態(tài)和氧化應激通路調(diào)控，而體內(nèi)存在著一種激活氧化應激的調(diào)控途徑。非對稱性二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine， ADMA）是內(nèi)源性一氧化氮合酶（nitric oxide synthase， NOS）抑制物，可與L-精氨酸競爭NOS 的結(jié)合位點并使其解偶聯(lián)，減少NO 合成，并增加超氧陰離子產(chǎn)生，導致氧化應激［6］。有研究顯示，ADMA蓄積與伴有和不伴有2 型糖尿病的高血壓患者的蛋白尿濃度呈正相關，且早期腎病患者血漿中也檢測到ADMA 含量升高，到終末期腎病時，血漿ADMA 進一步顯著升高［7-8］。此外，ADMA 含量也與CKD 兒童患者的腎功能指標腎小球過濾率呈負相關［9］。上述研究提示ADMA 可能與CKD 的早期腎損傷密切相關，但其是否通過激活細胞鐵死亡促早期腎臟損傷，尚未見文獻報導。因此，本研究通過ADMA 灌胃正常小鼠16周制備實驗小鼠模型，檢測糖脂代謝指標、ADMA/NOS/NO 通路及鐵死亡通路等指標，觀察ADMA 是否直接激活鐵死亡通路促早期腎損傷。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

ADMA ELISA 試劑盒購于晶美生物科技公司；ADMA 購于CSNpharm；胰島素購于Macklin；甘油三酯（triglyceride， TG）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol， TC）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol， HDL-C）試劑盒、組織鐵離子檢測試劑盒和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒均購于南京建成生物研究所；抗誘導型NOS（inducible NOS， iNOS）、內(nèi)皮型NOS（endothelial NOS， eNOS）、GPX4、Bcl2、Bax 和caspase-1 抗體均購于Cell Signaling Technology；β-actin 抗體購 于Abcam；兔Ⅱ抗、鼠Ⅱ抗、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6） ELISA 試劑盒、IL-1β ELISA 試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（malonaldehyde， MDA）檢測試劑盒和BCA Protein Assay Kit均購于上海碧云天生物公司。

2 主要實驗方法

2.1 NOS 抑制物ADMA 大鼠模型 8 周齡體重為（20±5） g 的SPF 級C57BL/6 雄鼠購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心［許可證號為SCXK（粵）2022-0002］。將16 只體重為（25±5）g 的SPF 級雄性C57BL/6 適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為正常對照（control）組和ADMA處理（ADMA）組，每組8 只。ADMA 組小鼠正常飲食，每天灌胃給予小鼠ADMA 60 mg·kg-1·d-1［10］，正常對照組小鼠正常飲食，每天灌胃給予等體積的生理鹽水，實驗周期為16 周。由于后續(xù)需要檢測的血清（每只300~500 μL）指標（TG、TC、HDL-C、BUN 和ADMA）比較多且需復孔，為了保證上述指標都能檢測到，所以選擇每組n=5；而收集的腎組織需要檢測HE 實驗，Western blot 實驗和ELISA 實驗等，待檢測的指標多且樣品處理方式不一樣，因此， HE 染色切片實驗每組選取n=8，而其他實驗n=5；口服糖耐量實驗（oral glucose tolerance test， OGTT）和胰島素耐受實驗（insulin tolerance test， ITT）實驗在模型構(gòu)建周期完成后進行檢測，每組n=5。

2.2 OGTT 根據(jù)文獻報導方法進行口服糖耐量實驗［11］，以評價胰島素敏感性。小鼠禁食12 h 后經(jīng)尾靜脈取血，使用血糖儀測定空腹血糖值（fasting blood glucose， FBG），然后給小鼠一次性灌胃葡萄糖溶液（2 g/kg），分別在灌胃后30、60、90 和120 min 時點測定血糖值（blood glucose， BG）；繪制血糖-時間曲線并計算曲線下面積（area under the curve，AUC），計算公式 為：AUC （mmol·L-1·min)=1/2×（BG0min+BG30min）×30+1/2×（BG30min+BG60min）×30+1/2×（BG60min+BG90min）×30+1/2×（BG90min+BG120min）×30。

2.3 ITT 根據(jù)文獻報導方法進行胰島素耐量實驗［12］，以評價胰島素耐受情況。小鼠禁食6 h后經(jīng)尾靜脈取血，使用血糖儀測定FBG，然后給小鼠一次性腹腔注射胰島素（0.75 U/kg），分別在注射后30、60、90 和120 min 時點測定，繪制血糖-時間曲線并計算AUC。

2.4 血脂檢測實驗 根據(jù)試劑盒的操作步驟，利用CPO-PAP 酶法檢測小鼠血清的TG 含量；CPO-PAP 酶法檢測血清的TC 含量；微板法檢測血清的HDL-C含量。

2.5 ELISA實驗 根據(jù)采購的ELISA試劑盒的操作步驟，首先配制標準品，并設置空白孔、標準品孔和待測樣本孔；分別將不同濃度標準品按照每孔100μL 加入相應孔中，而待測樣本則按照每孔加50 μL樣品和50 μL 樣品分析緩沖液，用封板膜封住反應孔，室溫孵育120 min；然后洗板5 次；每孔加入生物素化抗體100 μL，用封板膜（透明） 封住，室溫孵育60 min；再洗板5 次；每孔加入辣根過氧化物酶標記物100 μL，用封板膜封住反應孔，室溫避光孵育20 min；洗板5 次；每孔加入顯色劑100 μL，用封板膜封住反應孔，室溫避光孵育20 min；最后每孔加入終止液50 μL，混勻后立即測量A450值。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用t-test檢驗。檢驗水平取雙側(cè)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 ADMA可誘導小鼠糖代謝紊亂

如圖1 所示，OGTT 實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過ADMA（60 mg·kg-1·d-1）灌胃處理16 周后，ADMA 組小鼠在30、60、90 和120 min 時點的血糖均顯著高于正常對照組（P<0.01， 圖1A），并且其血糖-時間曲線下面積（OGTT-AUC）也顯著高于正常對照組（P<0.01， 圖1B）。ITT 實驗顯示，ADMA 組小鼠在30、60、90 和120 min 時點的血糖也均顯著高于正常對照組（P<0.01， 圖1C），并且其血糖-時間曲線下面積（ITTAUC）也顯著高于正常對照組（P<0.01， 圖1D）。

Figure 1.The effect of ADMA treatment on glucose tolerance of the mice.A： blood glucose levels in OGTT； B： the area under the concentration-time curve（AUC） in OGTT； C： blood glucose levels in ITT； D： the AUC in ITT.Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs control group.圖1 ADMA對小鼠糖耐受的影響

2 ADMA可誘導小鼠脂代謝異常

如表1 所示，與正常對照組小鼠相比，經(jīng)過ADMA（60 mg·kg-1·d-1）灌胃處理16 周后，ADMA 處理組小鼠血清的TG 和TC 的含量均顯著升高（P<0.01），而HDL-C的含量則顯著降低（P<0.05）。

表1 ADMA對小鼠血脂代謝的影響Table 1.The effect of ADMA treatment on lipid metabolism of the mice （mmol/L.Mean±SD. n=5）

3 ADMA損傷腎臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)

如圖2A、B 所示，與正常組小鼠相比，ADMA 處理組小鼠的腎重比顯著升高（P<0.01），并且BUN 的含量也顯著增多（P<0.01）。HE 組織染色實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，ADMA 組小鼠表現(xiàn)出一系列的腎病指標，ADMA 誘導小鼠的腎小球顯著肥大并脹裂、系膜細胞肥大、管腔變大等（圖2C）。

Figure 2.The kidney injury of ADMA-treated mice.A： the ratio of kidney weight to body weight in each group； B： the content of blood urea nitrogen （BUN） in each group； C： the morphological change of renal tissue in each group（HE staining， scale bar=20 μm； the number 1 black arrow indicates glomerular hypertrophy， the number 2 black arrow indicates mesangial cell hypertrophy， and the number 3 black arrow indicates tubular lumen dilatation in ADMA-treated mice）.Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs control group.圖2 ADMA對小鼠腎損傷的作用

4 ADMA誘導腎臟的炎癥反應

根據(jù)Western blot 實驗結(jié)果，與正常對照組相比，NOS抑制物ADMA處理16周后，顯著升高小鼠血清中的ADMA 含量（P<0.01， 圖3A），并顯著抑制小鼠腎組織中eNOS 的表達，但顯著增加了iNOS 的蛋白表達（P<0.01， 圖3B），顯著減少腎臟組織的NO含量（P<0.01， 圖3C），并且ELISA 實驗結(jié)果也顯示，腎臟組織的促炎因子IL-6 和IL-1β 含量也都相對于正常對照組顯著升高（P<0.01， 圖3D、E）。

Figure 3.The pro-inflammatory effect of ADMA-treated mice.A： the serum ADMA content in each group； B： the protein levels of nitric oxide synthase （eNOS and iNOS） in renal tissue； C： the NO content in renal tissue； D： the IL-6 level in renal tissue；E： the IL-1β content in renal tissue.Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs control group.圖3 ADMA對小鼠腎臟的促炎作用

5 ADMA誘導脂質(zhì)過氧化

通過檢測脂質(zhì)過氧化的最終代謝產(chǎn)物和抗氧化酶活性，以反映腎組織的脂質(zhì)過氧化情況。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，NOS 抑制物ADMA 顯著增加了正常小鼠腎臟組織脂質(zhì)過氧化，如抗氧化酶SOD活性顯著降低（P<0.05，圖4A）、脂質(zhì)過氧化最終代謝產(chǎn)物MDA顯著增加（P<0.01，圖4B）。

Figure 4.The lipid peroxidation in renal tissue of ADMA-treated mice.A： the antioxidant enzyme SOD activity in renal tissue； B：the MDA content in renal tissue.Mean±SD.n=5.*P<0.05， **P<0.01 vs control group.圖4 ADMA對小鼠腎組織脂質(zhì)過氧化的作用

6 ADMA激活鐵死亡

通過檢測鐵死亡相關指針，結(jié)果顯示，與正常對照組小鼠相比，NOS 抑制物ADMA 處理組小鼠腎組織的谷胱甘肽過氧化物酶4 蛋白表達顯著減低（P<0.01，圖5A），鐵離子含量顯著增加（P<0.01，圖5B），并且促凋亡蛋白Bax 和caspase-1 蛋白表達都顯著升高，而抗凋亡蛋白Bcl2 則顯著降低（P<0.05，P<0.01，圖5C）。

Figure 5.The ferroptosis in renal tissue of ADMA-treated mice.A： the protein level of GPX4 in renal tissue； B： the iron content in renal tissue； C： the protein levels of Bcl2， Bax and caspase-1 in renal tissue.Mean±SD.n=5.*P<0.05， **P<0.01 vs control group.圖5 ADMA對小鼠腎組織鐵死亡的作用

討 論

內(nèi)源性NOS 抑制物ADMA 在體內(nèi)主要抑制NO生成和誘導氧化應激的發(fā)生，參與了多種人類疾病發(fā)展，如心血管、糖尿病和CKD 等［13-15］。本研究首次顯示，ADMA 灌胃可直接誘導小鼠的腎重比和BUN含量增加、腎小球顯著肥大并脹裂、系膜細胞肥大及腎組織促炎因子IL-6 和IL-1β 增多等早期腎損傷的病理癥狀；并伴隨著脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物MDA 增加、抗氧化酶SOD 活性降低、組織鐵蓄積和GPX4 蛋白表達降低等，該結(jié)果表明ADMA 可誘導早期腎損傷，并激活腎組織鐵死亡。由此，本研究首次提出“ADMA 蓄積可能通過激活細胞鐵死亡促小鼠的早期腎損傷”的觀點。目前尚未見文獻報導ADMA 與鐵死亡通路在腎損傷的調(diào)控關系。但有文獻報導，通過微型滲透泵給予小鼠輸注ADMA 8 周，可顯著誘導小鼠的腎小球腫大和腎血管纖維化［10］；也有細胞實驗顯示，ADMA 和高糖均顯著增加大鼠腎成纖維細胞和系膜細胞的遷移、侵襲、增殖和細胞外基質(zhì)蛋白的積累等腎細胞纖維化的指標，而ADMA 水解酶的激動劑和NOS競爭性抑制劑L-精氨酸則可降低ADMA 的積聚，并顯著改善ADMA 誘導的腎細胞纖維化，結(jié)果表明ADMA 參與誘導腎細胞纖維化損傷［16］。另一方面，還有文獻顯示，與無處理的妊娠大鼠組相比，外源性NOS 抑制物L-NAME 灌胃處理不僅誘導大鼠胎盤組織抗氧化酶SOD 活性降低和脂質(zhì)過氧化代謝物MDA 顯著升高，并顯著降低鐵死亡標記物GPX4 蛋白表達，增加腎組織鐵蓄積，提示鐵死亡；使用鐵離子螯合劑去鐵胺治療則可逆轉(zhuǎn)外源性NOS 抑制物L-NAME 引起的細胞鐵死亡和胎盤損傷［17］，表明NOS抑制物蓄積可激活細胞鐵死亡通路。上述報道的研究結(jié)果是對本研究觀點的佐證，但ADMA如何誘導鐵死亡尚未清楚。

目前，已知高血糖、肥胖和高脂血癥是CKD早期發(fā)生的獨立危險因素，糖脂代謝紊亂有害于腎功能［18-19］。因此，本研究觀察了ADMA灌胃處理對正常小鼠糖脂代謝的影響。OGTT 和ITT 實驗都顯示，與正常對照組相比，ADMA 處理顯著升高0~120 min 的血糖濃度，提示糖耐受和胰島素耐受；并且ADMA 直接誘導小鼠的脂代謝異常，如血清中TG 和TC 含量都顯著升高，HDL-C 則顯著降低，提示ADMA 誘導小鼠糖脂代謝紊亂；此外，NOS 抑制物ADMA 處理可增加小鼠血清ADMA 的含量，也顯著降低腎組織中eNOS 蛋白表達和總NO 含量。這是因為NO 參與介導胰島素的分泌［20-21］，而NOS 抑制物ADMA 通過抑制NOS 活性和蛋白表達，減少胰腺B 細胞NO 的合成，從而導致分泌的胰島素降低，血糖升高［22-23］。在糖代謝方面，高糖孵育可誘導HK-2 腎小管上皮細胞細胞產(chǎn)生大量活性氧，對腎細胞形成氧化應激性損傷和脂質(zhì)過氧化，從而誘導細胞鐵超載和鐵死亡［24］；在脂代謝方面，膽固醇脂質(zhì)極容易被過氧化生成各種CH-OOH 產(chǎn)物，并且在鐵的存在下，CH-OOH 可將相鄰的脂類過氧化，促進脂質(zhì)過氧化，進而激活鐵死亡［25-26］。這些研究佐證了本研究中結(jié)果，即NOS 抑制物ADMA 可能通過誘導糖脂代謝紊亂促進小鼠腎組織氧化應激性損傷和脂質(zhì)過氧化，從而激活鐵死亡通路。

本研究還觀察到ADMA 可直接誘導小鼠腎臟的炎癥反應，如促炎因子IL-1β、IL-6 和iNOS 蛋白表達都顯著增加，并伴隨著Bcl2/Bax/caspase通路的改變。炎癥反應是因為ADMA 蓄積除了抑制NO 合成外，同時也會產(chǎn)生大量的活性氧，氧化應激可誘導炎癥的發(fā)生［14，27］。此外，有研究報導，在脂多糖誘導的急性腎炎癥損傷小鼠模型中觀察到，腎組織中的抗凋亡蛋白Bcl2 表達降低，促凋亡蛋白Bax 和caspase-1 蛋白表達上調(diào)，而通過抗氧化劑抑制小鼠腎炎癥損傷后，也顯著抑制Bcl2/Bax/caspase凋亡通路，這提示炎癥反應可調(diào)控Bcl2/Bax/caspase 通路［28］；還有研究顯示，在肺腺癌細胞中，白花蛇舌草注射液可通過抑制Bcl2、促進Bax 表達激活電壓依賴性陰離子通道2/3，進而誘導細胞鐵死亡［29］。上述研究提示，ADMA 誘導的促炎反應可能通過抑制Bcl2 和促進Bax 進而誘導細胞鐵死亡。

綜上所述，本研究揭示了內(nèi)源性NOS 抑制物ADMA 蓄積可誘導小鼠的早期腎損傷，其機制其一是ADMA 誘導小鼠的糖脂代謝紊亂引起腎臟的氧化應激和脂質(zhì)過氧化，進而激活鐵死亡誘導小鼠腎損傷；其二是ADMA 可能通過促炎因子IL-6 直接降低GPX4 表達，誘導腎臟細胞鐵死亡，以及炎癥反應可能通過調(diào)控Bcl2/Bax/caspase 通路誘導細胞鐵死亡，從而促使早期腎損傷的發(fā)生。