三百棒通過調控TLR4/NF-κB信號通路對脂多糖誘導的RAW264.7細胞極化的影響*

張宗星， 劉道忠， 江 露， 李瑋怡， 包卓瑪， 萬兆逸，向 珊， 陳 丹， 袁 林，3△

（1湖北民族大學風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；2湖北民族大學醫學部，湖北恩施 445000；3湖北省腎臟病臨床醫學研究中心，湖北 恩施 445000；4湖北恩施學院，湖北 恩施 445000）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種慢性自身免疫性疾病，以侵犯關節及周圍組織為主，主要特征為淋巴細胞、巨噬細胞等多種免疫細胞和炎癥介質相互作用［1-2］，最新數據統計顯示RA的患病率為0.4%~1.3%［3］，是目前臨床上致殘率最高的關節疾病［4］。巨噬細胞廣泛存在于關節的滑膜和軟骨中，其作為炎癥性疾病最主要的免疫防御細胞，可以釋放促炎介質促進炎癥因子的形成，引起骨和軟骨的病理性吸收和破壞［5］。巨噬細胞極化失衡與RA的發生和發展密切相關，巨噬細胞可根據周圍微環境的變化極化為促炎的M1 型和抗炎的M2 型，介導免疫/炎癥反應和修復，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的RAW264.7 小鼠巨噬細胞是經典的M1型巨噬細胞。M2型巨噬細胞也稱為選擇性激活巨噬細胞，在免疫中主要表現出抗炎作用，抑制炎癥反應。巨噬細胞在炎癥極化的過程中能通過分泌大量促炎細胞因子，激活成纖維細胞和促炎性破骨細胞，加速炎癥反應，造成組織和關節的破壞。因此，靶向巨噬細胞極化可能是治療RA 的新策略，對巨噬細胞的炎癥極化進行更為深入的研究具有重大意義。

三百棒來源于蕓香科Toddalia屬植物飛龍掌血的根，在湖北恩施土家族地區被廣泛用于治療風濕性疾病。《土家族藥物志》記載其可以祛風除濕、活血舒筋、消腫止痛，主治風寒濕痹癥［6］。現代藥理研究證實，三百棒提取物具有多種生物活性，包括抗風濕［7］、抗炎［8］、抗氧化［9］、抗腫瘤［10］等作用。

Toll樣受體4（Toll-like factor 4， TLR4）/核因子κB（nuclaer factor-κB， NF-κB）信號通路是經典的炎癥信號通路，對人體內關節細胞從增殖分化到代謝凋亡的進程起著關鍵的調控作用［11］。本課題組前期研究表明三百棒具有很好的抗炎作用［12-13］。張譽丹［14］的體外實驗研究表明，三百棒醇提物（Toddalia asiaticaalcohol extract， TAAE）可通過TLR/NF-κB 通路成功誘導RA中成纖維細胞樣滑膜細胞凋亡。南奕陽［6］通過建立膠原誘導的關節炎大鼠模型進一步表明TAAE 可通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路的炎癥放大效應，減輕炎癥反應。三百棒還可通過PI3K/AKT/mTOR信號通路促進LPS 誘導的RAW264.7 細胞自噬并抑制炎癥反應［15］。目前關于三百棒抗關節炎的機制研究并不完整，因此本研究通過RA 體外炎癥模型探討TAAE對RAW264.7細胞極化、炎癥反應及TLR4/NFκB信號通路的影響，旨在闡明TAAE 治療RA 的可能機制，為臨床治療RA提供理論依據，同時也為土家族藥物三百棒的進一步開發和應用提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 細胞株

小鼠單核-巨噬細胞系RAW264.7（貨號：CL-0190）購自武漢普諾塞生命科技有限公司。

2 主要試劑

無水乙醇（武漢市中天化工有限公司，批號：20220228）；甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20220112）；結晶紫染液（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1062）；逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR 試劑盒（新貝生物公司，批號分別為F2997 和F2967）；胎牛血清（上海逍鵬生物科技有限公司，批號：2110053）；青-鏈霉素溶液（吉諾生物醫藥技術有限公司，批號：1712180106）；DMEM 培養液、PBS、PMSF 蛋白酶抑制劑和CCK-8 試劑盒（大連美侖有限公司，批號分別為MA0212-Jun-08H、MA0016-Apr-09E、101321211021 和MA0218-5）；0.25%胰酶+0.2%EDTA（武漢科瑞生物技術有限公司，批號：2208190517）；RIPA 裂解液（中國碧云天生物技術有限公司，批號：P0013B）；BCA 蛋白檢測試劑盒和ECL超敏發光液（武漢科瑞生物技術有限公司，批號分別為20000311 和2021120617）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號：071222220721）；Goat Anti-Rabbit IgG，Goat Anti-Mouse IgG，以及TLR4、iNOS、COX-2、NF-κB、p-NFκB、IκBα 和p-IκBα 抗 體（ABclonal，批 號 分 別 為20000311、20000275、A5258、A3774、A3560、A2547、AP0123、A19714和AP0707）。

3 主要方法

3.1 TAAE 的制備 三百棒采于湖北省恩施州咸豐縣，經湖北民族大學附屬民大醫院制劑室張國安主任藥師鑒定為飛龍掌血Toddalia asiatica（L.） Lam。藥材標本（No.20200809）現保存于湖北民族大學醫學部。本研究主要使用三百棒的根皮。參照本課題組前期處理方法［6，14］：取100 g 粉碎過后的三百棒根皮，加入5 倍體積的70%乙醇浸泡充分浸泡數小時后，85 ℃恒溫加熱，反復提取5 次，合并藥液并旋蒸濃縮藥液，使終濃度為1 g/mL。將濃縮過后的藥液平鋪分裝至多個底面平整的容器內，并用保鮮膜封口，放入-20 ℃冰箱過夜。然后-80 ℃真空冷凍干燥24 h，裝袋、稱重、標記，保存在干燥處防止受潮。

3.2 藥物處理

3.2.1 TAAE溶液的配制 稱取1.5 g TAAE凍干粉放入50 mL 的離心管中，用1× PBS 溶解，定容至15 mL 封口，超聲1 h，在超凈工作臺中打開，用0.22 μm的微孔濾膜過濾3次，EP管分裝，放入4 ℃冰箱備用。

3.2.2 LPS溶液的配制 無菌環境下，取10 mL無菌PBS溶解10 mg LPS粉末，配成1 g/L LPS母液，1.5 mL離心管分裝，-20 ℃保存，使用時稀釋至所需濃度。

3.3 細胞培養和分組 RAW264.7 細胞在DMEM培養液（含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素）中培養，置于37 ℃、5% CO2培養箱中。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，每24 h 換一次液，當細胞生長至80%~90%時，輕輕吹打細胞，使貼壁細胞脫落或使用細胞刮順著一個方向輕輕將細胞刮下，按1∶3 的比例進行傳代，傳2~3 代之后用于后續實驗。將細胞分為正常對照（control）組、LPS（1 mg/L）組和TAAE（0.25、0.5、1 和2 g/L）組；Western blot 和免疫熒光實驗增加TAK-242（TLR4 抑制劑，0.2 mmol/L）組。除對照組外，其余組均用1 mg/L LPS 刺激以誘導細胞極化和炎癥。藥物作用24 h后，收集細胞用于后續實驗。

3.4 CCK-8 法檢測TAAE 對RAW264.7 細胞活力的影響 用TAAE（0、0.25、0.5、1 和2 g/L）加或不加LPS（1 mg/L）干預24 h 后，將含有10% CCK-8 試劑（0.5 g/L）的細胞培養液加入每個孔中，避光孵育30 min。用酶標儀在450 nm 處測定每個孔的吸光度（A），再計算細胞相對活力。每個實驗重復3 次。細胞相對活力=（A加藥-A空白）/（A0加藥-A空白）。

3.5 Transwell實驗檢測TAAE對RAW264.7細胞遷移和趨化性的影響 按3.3 分組及藥物干預后，將RAW264.7 細胞以2×105個/孔的密度接種到Transwell 上室24 孔板中。細胞遷移可以由血清驅動，因此將細胞在無血清DMEM 高糖培養液中培養12 h，以消除血清的影響。為了測試遷移能力，將補充10%胎牛血清的500 μL DMEM 高葡萄糖培養液添加到Transwell 下室中。為了研究趨化性，將含有1 mg/L LPS 的500 μL 無血清DMEM 高葡萄糖培養液添加到Transwell 下室中。然后，將培養板在37 ℃、5% CO2下培養24 h，棄去腔室中的培養液，用PBS 洗滌2次。將小室用甲醇固定30 min，擦去上室中的細胞。將腔室風干后，在0.1%結晶紫溶液中染色15 min，隨后將其洗掉。風干后，在顯微鏡下觀察腔室。每個腔室隨機選擇5個視野，并以200倍的放大倍率拍攝圖像。計數穿過膜的細胞數量用于評估細胞的遷移和趨化性。每個實驗重復3次。

3.6 Griess 法檢測細胞培養上清液一氧化氮（nitric oxide， NO）水平 取對數生長期的RAW264.7細胞，以每孔2×105個的密度接種于6孔板，待細胞貼壁后，按3.3 分組及藥物干預24 h 后，收集細胞培養上清液，按照NO試劑盒說明書進行檢測。

3.7 ELISA檢測細胞培養上清液中炎癥因子水平RAW264.7 細胞分組同3.3，藥物干預24 h 后收集細胞培養上清液，用TNF-α、IL-1β 和IL-10 ELISA 試劑盒檢測細胞因子含量。設置7 個標準品，將不同濃度標準品和實驗樣本每孔100 μL 加入到96 孔板中，37 ℃孵育60 min，洗滌5 次，每次震蕩或靜置40 s。每孔加入100 μL抗體工作液，37 ℃孵育30 min，洗滌5 次。每孔再加入100 μL 酶結合物工作液，37 ℃孵育30 min，洗滌5 次。最后每孔加入100 μL 顯色底物工作液，37 ℃孵育15 min 后加入100 μL 終止液混勻。使用酶標儀測量A值，通過樣本的A值計算炎癥因子濃度。

3.8 熒光染色雙標法檢測細胞極化狀態 收集對數生長期的RAW264.7 細胞，調整細胞懸液濃度，按照8×107L-1密度將細胞接種到6 孔板中，每孔2 mL。6 孔板底放入細胞爬片；貼壁后，按3.3 分組及藥物干預24 h 后加入2 mL 4%多聚甲醛，室溫固定30 min；100 μL 破膜工作液破膜20 min；3%牛血清白蛋白封閉30 min；滴加Ⅰ抗（大鼠抗小鼠CD68 抗體和兔抗小鼠CD163 抗體），濕盒內4 ℃孵育過夜；滴加Ⅱ抗室溫孵育50 min；DAPI復染細胞核；抗熒光淬滅封片劑封片，鏡檢拍照。結果判讀：CD68+呈紅色熒光，CD163+呈綠色熒光，用ImageJ 軟件進行細胞計數，計算CD163+/CD68+RAW264.7 細胞所占比例以反映RAW264.7細胞極化情況。

3.9 免疫熒光檢測NF-κB 核移位 細胞處理同熒光染色雙標法。3%牛血清白蛋白封閉30 min后滴加兔抗小鼠NF-κB 抗體，濕盒內4 ℃孵育過夜；滴加Ⅱ抗室溫孵育50 min；DAPI復染細胞核；抗熒光淬滅封片劑封片，鏡檢拍照。用ImageJ軟件進行細胞計數。

3.10 Western blot 檢測相關因子表達 按3.3 進行分組與藥物干預后，離心收集細胞；加入RIPA 細胞裂解液，冰上裂解30 min 后，離心收集上清，提取細胞蛋白，BCA 法測定總蛋白濃度。各孔取相應的蛋白上樣，于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離（濃縮膠電壓70 V，30 min；分離膠電壓110 V，60 min）。將分離后的蛋白電轉移（280 mA，90 min）至PVDF 膜。加入封閉液于搖床上室溫封閉2 h；TBST洗膜3 次，每次5 min；分別加入Ⅰ抗（均1∶1 000 稀釋），4 ℃反應過夜；次日先以TBST 洗膜3 次，每次10 min；后加入HRP 標記的Ⅱ抗（1∶20 000 稀釋），室溫反應2 h；再用TBST 洗膜3 次，每次10 min。按ECL試劑盒說明進行曝光顯影。采用ImageJ 軟件對蛋白條帶灰度值進行分析。

3.11 RT-qPCR 檢測相關因子的mRNA 水平 取出-80 ℃冰箱中保存的含有Trizol 的新鮮冰凍滑膜組織，自然溶解，用Roche 勻漿儀研磨成漿，移至無RNase 的1.5 mL EP 管中，充分裂解，根據RNA 提取試劑盒的步驟，提取總RNA。實時熒光定量PCR 選用10 μL 反應體系，反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 個循環。繪制熔解曲線，最終數據以2-ΔΔCt法進行分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

4 統計學處理

用SPSS 23.0 統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 TAAE或TAAE+LPS對細胞活力的影響

用TAAE 或TAAE+LPS（1 mg/L）干預RAW264.7細胞24 h，TAAE 在2 g/L 濃度以下對細胞不存在毒性作用，而1 mg/L LPS 干預24 h 對細胞活力無明顯影響，見圖1。結合相關文獻［15-16］，選取0.25、0.5 和1 g/L TAAE及1 mg/L LPS用于后續實驗。

Figure 1.Effects of Toddalia asiatica alcohol extract （TAAE） and lipopolysaccharide （LPS） on the viability of RAW264.7 cells.A：the cells were treated with different concentrations （0.25， 0.5， 1 and 2 g/L） of TAAE for 24 h， and the cell viability was detected by CCK-8 assay； B： the cells were treated with TAAE （0.25， 0.5， 1 and 2 g/L） and LPS （1 mg/L） for 24 h， and the cell viability was detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n=6.*P<0.05， **P<0.01 vs control group（without TAAE or LPS treatment）.圖1 三百棒醇提物和脂多糖對RAW264.7細胞活力的影響

2 TAAE對RAW264.7細胞形態的影響

如圖2 所示，control 組RAW264.7 細胞為圓形；LPS 處理誘導細胞分化，細胞長出觸角變為紡錘形；與LPS 組相比，TAAE 干預抑制了細胞形態的變化，高劑量（1 g/L）TAAE組更明顯。

Figure 2.Effect of Toddalia asiatica alcohol extract （TAAE） on the morphological changes of RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide （LPS） was observed by microscopy （×200）.圖2 三百棒醇提物對脂多糖誘導的RAW264.7細胞形態的影響

3 TAAE對RAW264.7細胞遷移和趨化性的影響

為研究TAAE 如何影響胎牛血清或LPS 誘導的RAW264.7 細胞的遷移和趨化性，進行了Transwell實驗。如圖3A 所示，血清誘導的細胞成功跨膜（遷移），但0.5 和1 g/L 的TAAE 顯著減少跨膜細胞數量，分別為control組的33%和50%（P<0.01）。同樣，LPS 誘導的細胞成功跨膜（趨化性），但0.5 和1 g/L的TAAE顯著減少跨膜細胞數量，分別為control組的30%和48%（P<0.01），見圖3B。

Figure 3.Toddalia asiatica alcohol extract （TAAE） inhibited migration （A） and chemotaxis （B） of RAW264.7 cells treated with fetal bovine serum or lipopolysaccharide（LPS）.The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group （without TAAE or LPS treatment）.圖3 三百棒醇提物抑制胎牛血清或脂多糖處理的RAW264.7細胞遷移和趨化

4 TAAE 對LPS 干預后RAW264.7 細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-6和NO含量的影響

如圖4 所示，與control 組相比，LPS 組細胞培養上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β 和NO 含量顯著升高，IL-10 含量顯著降低（P<0.01）；與LPS 組相比，各劑量TAAE 均可顯著降低上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和NO含量，升高IL-10含量（P<0.05）。

Figure 4.Effects of Toddalia asiatica alcohol extract （TAAE） on the levels of inflammatory cytokines and nitric oxide（NO） in culture supernatants RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide （LPS）.A： IL-10； B： IL-1β； C： IL-6； D： TNF-α； E：NO.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs LPS group.圖4 三百棒醇提物對脂多糖誘導的RAW264.7細胞培養上清液中炎癥因子及NO含量的影響

5 TAAE 對RAW264.7 細胞CD163+/CD68+比值的影響

采用免疫熒光雙標法檢測巨噬細胞極化狀態，CD163+為紅色熒光，CD68+為綠色熒光。與control組比較，LPS 組CD163+/CD68+比值降低（P<0.01）；與LPS 組比較，TAAE 組和TAK-24（TLR4 抑制劑）組CD163+/CD68+比值升高，見圖5。這表明LPS 誘導的巨噬細胞以M1型極化為主，TAAE可以降低M1型巨噬細胞極化的比例，促進巨噬細胞向M2 型極化，且與TAK-242效果相當。

Figure 5.Effect of Toddalia asiatica alcohol extract （TAAE） on the phenotype transformation of RAW264.7 macrophages induced by lipopolysaccharide （LPS） was detected by fluorescence staining with double labeling （scale bar=50 μm）.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs LPS group.圖5 熒光染色雙標檢測三百棒醇提物對脂多糖誘導的RAW264.7巨噬細胞表型轉化的影響

6 TAAE 對LPS 誘導的RAW264.7 細胞NF-κB 活化的影響

與control組比較，LPS顯著誘導NF-κB從細胞質到細胞核的易位；與LPS 組比較，TAAE 組和TAK-24組NF-κB 的核轉移明顯受到抑制，見圖6。這表明TAAE 可以抑制LPS 誘導的RAW264.7 細胞NF-κB核易位，且與TAK-242效果相當。

7 TAAE 對LPS 誘導的RAW264.7 細胞炎癥相關蛋白及TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達的影響

與control 組比較，LPS 組細胞中iNOS、COX-2、p-NF-κB、TLR4 和p-IκBα 蛋白水平顯著升高，IκBα 蛋白表達顯著減少（P<0.01）；與LPS 組相比，各劑量TAAE 和TAK-24 均能降低LPS 誘導的iNOS、COX-2、p-NF-κB、TLR4 和p-IκBα 蛋白水平，升高IκBα（P<0.05），而總NF-κB 無變化，見圖7。這表明TAAE 能抑制炎癥相關蛋白表達，抑制IκBα 蛋白的磷酸化降解，從而抑制TLR4/NF-κB信號通路的活化。

8 TAAE 對LPS 誘導的RAW264.7 細胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1、NF-κB 和TLR4 mRNA水平的影響

與control 組比較，LPS 組中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6，以及NF-κB、TLR4 的mRNA 水平顯著升高，抑炎因子IL-10 和Arg-1 的mRNA 水平顯著降低（P<0.01）；與LPS 組相比，各劑量TAAE 均能降低LPS 誘導的RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB和TLR4 的mRNA 水平，升高IL-10 和Arg-1 的mRNA 水平（P<0.05或P<0.01），見圖8。

Figure 8.Effects of Toddalia asiatica alcohol extract （TAAE） on the mRNA levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， IL-10， Arg-1， NF-κB and TLR4 in RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide （LPS） were determined by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs LPS group.圖8 RT-qPCR 檢測三百棒醇提物對脂多糖誘導的RAW264.7 細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1、NF-κB 和TLR4 mRNA水平的影響

討 論

RA 是一種以滑膜增生和關節組織進行性破壞為特征的慢性疾病，其病理學變化主要涉及促炎細胞因子釋放，滑膜中持續炎癥細胞浸潤和軟骨中活化的巨噬細胞侵蝕［17］。RA 的起始原因尚未完全明了，但已證實巨噬細胞在RA 疾病過程中起關鍵作用，它們能夠協調免疫反應，釋放參與炎癥級聯反應的細胞因子和酶，進而激活破骨細胞和成纖維滑膜細胞，導致關節破壞和疾病延續［18］。RAW264.7 細胞被認為是晚期分化階段的破骨前身細胞，因此較適合用于以炎癥和骨吸收為主的如RA 等關節疾病研究。在RA 炎癥刺激下它可以極化為促炎M1 表型，釋放大量促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8等。因此，在RA 發作期間靶向巨噬細胞極化，將促炎M1 型巨噬細胞逆轉為抗炎M2 表型，可能成為一種有效的治療方法［19］。LPS 是革蘭氏陰性菌細胞壁的一種重要組成成分，能夠誘導機體的免疫反應，是巨噬細胞強有力的活化劑［20］。LPS的刺激可誘導M1型巨噬細胞，M1 激活的生物標志物包括TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2、NO、iNOS、CD68 等，炎癥因子的上調形成強烈的炎癥級聯反應，誘導滑膜增生并增強RA 的組織病理學變化，從而導致RA 中的滑膜炎癥和關節破壞［21］。研究發現在RA 炎癥滑膜和血管翳處存在大量活化巨噬細胞，而活化的巨噬細胞高表達促炎因子、趨化因子、生長因子和基質金屬蛋白酶等多種效應分子，參與炎癥的啟動和維持，具有廣泛的促炎作用和組織破壞能力。因此調節巨噬細胞極化平衡是RA治療的潛在策略［22］。

本研究通過免疫熒光雙標法檢測巨噬細胞極化，發現巨噬細胞經LPS 誘導后，與control 組相比可促進巨噬細胞M1 表型標志物iNOS 和CD68 的表達，抑制M2 表型標志物清道夫受體（CD163）的表達，使CD163+/CD68+比值降低，說明LPS誘導的巨噬細胞以M1 型極化為主。然而，TAAE 治療使CD163+/CD68+比值升高，降低M1 型巨噬細胞極化的比例，促進巨噬細胞向M2 型極化，且效果與TAK-242 效果相當。經LPS 誘導后巨噬細胞釋放的炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β 含量明顯增多，抑炎因子IL-10和Arg-1含量減少，上清液中NO 含量升高，細胞由正常的圓形變為紡錘形；在給予TAAE 干預后，促炎細胞因子含量均有顯著下降，抑炎細胞因子含量上升，具有分化形狀的RAW264.7 細胞數量減少，同時TAAE 能抑制RAW264.7 細胞遷移和趨化，降低LPS 誘導的RAW264.7 細胞iNOS、COX-2、TLR4、p-NF-κB 和p-IκBα 蛋白水平，降低TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB 和TLR4 mRNA 水平，升高IL-10 和Arg-1 mRNA 水平。這提示TAAE 對炎癥損傷具有一定的治療作用，可能是通過抑制RAW264.7 遷移和趨化，使其向抗炎M2型分化，從而發揮抗炎作用。

三百棒是土家族常用的一種天然抗炎藥物，湖北民族大學附屬民大醫院以其為主要藥物研制的土家抗風濕復方三百棒藥酒和金邊祛風飲臨床用于治療類風濕十余年，療效確切。本課題組前期研究表明，三百棒醇提物通過TLR4/NF-κB 信號通路降低炎癥反應，對膠原誘導關節炎大鼠有明顯的改善作用［6］，還可通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路中相關細胞因子的表達，抑制滑膜細胞的增殖［14］。

目前，許多調節機制參與了RA 的發病機制，其中包括TLR4/NF-κB“細胞炎癥”途徑。已有研究表明TLR4/NF-κB 通路在炎癥調節方面有重要作用［23］，TLR4/NF-κB 信號傳導的調節已被提出作為治療免疫介導性關節炎的潛在療法，TLR4/NF-κB 還參與M2 型巨噬細胞極化，其在限制LPS 刺激的巨噬細胞中的炎癥反應中起著關鍵作用［24］。NF-κB 由5 種重要蛋白質形成，它們通過與其抑制蛋白IκB 結合，作為無活性的異二聚體復合物存在于細胞質中。P65是NF-κB 調節和功能最具代表性的蛋白質。在被各種炎癥刺激（如LPS）激活后，IκB 激酶的激活會引發IκBα 的磷酸化和降解。NF-κB 磷酸化之后使NF-κB發生核易位，進入細胞核與DNA 結合并激活促炎基因的表達，包括細胞因子、粘附分子和誘導性酶（如iNOS和COX-2）［25］。本研究證實了TLR4/NF-κB途徑在RAW264.7 細胞炎癥與極化中的關鍵作用，活化的RAW264.7 細胞中的細胞因子導致TLR4/NF-κB途徑的激活，促炎M1 細胞增多。TAAE 可抑制NFκB 的核易位抑制TLR4/NF-κB 途徑的激活，使M1 型細胞向M2 型轉化。另外，本實驗應用抑制劑TAK-242阻斷TLR4/NF-κB信號通路導致細胞炎癥因子及炎癥相關蛋白含量減少，且TAAE 治療效果與其相當。因此，這也表明TLR4/NF-κB 信號通路參與了炎癥與細胞極化的調節。目前，通過基因干預方法敲除或小分子藥物（TLR4 抑制劑TAK-242）抑制TLR4/NF-κB 通路，阻斷其對下游多種效應分子的活化已經成為RA 治療研究的新靶點［26］。本研究中，TAAE通過抑制巨噬細胞的炎癥反應并抑制其遷移和趨化，調節巨噬細胞極化平衡，其作用機制可能與抑制TLR4/NF-κB 信號通路有關。同時，本研究為開發三百棒治療RA提供了進一步的證據。