m6A修飾與阿爾茨海默病的研究進展*

劉丹丹， 秦合偉，2△， 孫孟艷， 王夢楠， 高 洋， 牛雨晴， 宋雪梅

（1河南中醫藥大學康復醫學院，河南 鄭州 450046；2河南中醫藥大學第二附屬醫院康復醫學科，河南 鄭州 450002）

N6-腺苷甲基化（N6-adenosine methylation， m6A）是將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基添加到腺苷N6位點的表觀遺傳修飾，在20 世紀70 年代被鑒定出來，占成人大腦中全部信使RNA（messenger mRNA）堿基甲基化的80%以上［1］，還可發生在微小RNA、長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA， lncRNA）、環狀RNA（circular RNA， circRNA）、轉運RNA（transfer RNA，tRNA）和核糖體RNA中［2］。阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease， AD）是一種常見異質性的神經退行性癡呆類型，在85 歲及以上的人群中，近一半患有AD［3］。由于病因尚未明確，迫切需要發現新的致病途徑來揭示AD 潛在分子機制。m6A 修飾目前已成為研究AD 的前沿熱點。越來越多的研究顯示，m6A 修飾與AD 存在密切聯系，參與m6A 修飾的酶通過識別靶RNA 中的RRACH 序列，介導靶RNA 轉錄后翻譯或降解，從而對機體產生一系列影響。因此，本文綜述m6A 修飾干預AD 的作用機制，以期揭示m6A 修飾參與AD 病理機制的現有前期依據，為日后尋求AD 早期生物標志物和實驗證據提供理論支撐。

1 m6A修飾的概述

RNA 甲基化是一種在基因水平上通過甲基化調節RNA 轉錄后剪接、穩定性、翻譯和降解的一種生物學功能修飾［4］，其中m6A修飾是真核生物中含量最豐富的mRNA 修飾，占甲基化核糖核苷酸總量的50%，且廣泛存在于哺乳動物的大腦［5］?；驕y序分析顯示，m6A 修飾主要分布在高度保守的RRACH（R=G 或A，H=A 或C 或U）序列中，并在3'非翻譯區和終止密碼子附近富集［6］。此外，m6A 修飾是一個動態且可逆的過程，其形成和調控主要由甲基轉移酶（writers）、去甲基轉移酶（erasers）和甲基化閱讀蛋白（readers）介導，其中甲基轉移酶和去甲基轉移酶通過添加和移除甲基使m6A 修飾動態可逆，甲基化閱讀蛋白通過識別m6A修飾的RNA以發揮相應的生物學功能［7］。m6A修飾的生物學機制見圖1。

Figure 1.Biological mechanism of m6A modification.圖1 m6A修飾的生物學機制

1.1 甲基轉移酶 m6A 經充當“書寫器（writers）”的甲基轉移酶復合物催化形成，使得S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基可以添加到腺苷N6位點上。這些“writers”主要包括甲基轉移酶樣因子3（methyltransferase-like 3， METTL3）、METTL14、腎母細胞瘤1 相關蛋白（Wilms' tumor 1-associated protein， WTAP）、RNA 結合基序蛋白15（RNA binding motif protein 15，RBM15）、含鋅指CCCH 型蛋白13（zinc finger CCCHtype containing protein 13， ZC3H13）、病毒樣m6A 甲基轉移酶相關蛋白（vir-like m6A methyltransferase-associated protein， VIRMA）、E3 泛素連接酶HAKAI、METTL16 等［8］。METTL3 和METTL14 是甲基轉移酶復合物發揮作用的核心：METTL3作為S-腺苷甲硫氨酸結合亞基的關鍵組分，具有m6A 與RNA 結合的催化結構域；METTL14 為m6A 與RNA 結合提供底物識別支架，協助METTL3 提高催化效率［9］。WTAP 可與METTL3 和METTL14 結合發揮穩定作用并誘導其在核斑點定位［10］。RBM15 通過與METTL3 和WTAP 以依賴性方式結合，募集復合物到特定RNA 位點進行m6A 修 飾［11］。 ZC3H13 將ZC3H13-WTAP-VIRMAHAKAI復合物錨定在細胞核中以促進m6A 修飾和小鼠胚胎干細胞更新［12］。VIRMA募集甲基轉移酶復合物并介導3'非翻譯區附近腺嘌呤堿基的甲基化，還可以與聚腺苷酸切割因子相互作用，安裝在終止密碼子附近和mRNA 的3'非翻譯區［13］。HAKAI可與鋅指蛋白1和鋅指蛋白2相互作用，增強甲基轉移酶的穩定性［14］。METTL16 作為U6 剪接體小核RNA 的甲基轉移酶，發揮穩定S-腺苷甲硫氨酸的作用［15］。

1.2 去甲基轉移酶 m6A 修飾可被稱為“橡皮擦（erasers）”的去甲基轉移酶逆轉。這些“erasers”主要屬于ALKB 家族，包括脂肪質量及肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein， FTO）和AlkB 同系物5（AlkB homolog 5， ALKBH5），以Fe（II）和α-酮戊二酸依賴的方式催化m6A 去甲基化［16］。FTO 是2011 年第一個被發現的去甲基轉移酶，催化m6A 氧化成N6-羥甲基腺苷和N6-甲基腺苷兩種中間體［17］。ALKBH5是另一種去甲基轉移酶，可直接將m6A逆轉為腺苷，顯著影響核斑點中mRNA 加工因子的組裝、輸出和代謝［2］。此外，ALKBH3 能夠去除tRNA 的m6A修飾并提高蛋白質的翻譯效率［18］。

1.3 甲基化閱讀蛋白 甲基化閱讀蛋白是一種能夠選擇性識別和解碼RNA上的m6A修飾并產生功能信號的“閱讀器（readers）”，主要包括YTHN6-甲基腺苷RNA 結 合 蛋 白1/2/3（YTHN6-methyladenosine RNA-binding protein 1/2/3， YTHDF1/2/3）、含YTH 結構域蛋白1/2（YTH domain-containing 1/2， YTHDC1/2）、核內不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein， HNRNP）、真核起始因子3（eukaryotic initiation factor 3， eIF3）和胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白1/2/3（insulin-like growth factor 2 mRNAbinding protein 1/2/3， IGF2BP1/2/3）［19］。YTHDF1 通過與eIF3 結合觸發翻譯啟動來促進靶蛋白翻譯，同時YTHDF1 和YTHDF2 可以與YTHDF3 競爭性結合，最終確定靶mRNA 翻譯或衰變修飾［20］。YTHDF2的N 末端區域和CCR4-NOT 去烯化酶復合物相互作用，被招募到含有m6A 的mRNA 中，引發衰變和去烯化［21］。YTHDF2 和YTHDF3 結合將mRNA 從活躍翻譯的mRNA 池轉運到衰變的mRNA 池，導致mRNA降解［22］。YTHDC1 募集特異性剪接因子調節mRNA剪接、加速mRNA 核輸出和促進特定轉錄本的衰變［23］。YTHDC2 通過其解旋酶提高翻譯效率或降低mRNA 的 含 量［24］。研 究 表 明，HNRNP 家 族 中 的HNRNPA2B1 可與含有m6A 修飾的原代mRNA 結合并促進mRNA 成熟［25］。IGF2BP1/2/3 以m6A 依賴性方式穩定靶基因并進行翻譯［26］。

2 m6A修飾參與AD的實驗證據

研究顯示，m6A 修飾和AD 的病理機制有著緊密聯系，在AD 領域，對m6A 修飾的研究剛剛興起，諸多實驗證據均證實AD 患者中甲基化修飾相關酶的豐度和組成均發生變化，并通過改變β-淀粉樣肽（amyloid β-peptide， Aβ）斑的生成和降解、τ 蛋白（tau protein）過度磷酸化程度及小膠質細胞活化介導的神經炎癥等途徑參與AD 的具體發病機制［27］。m6A 修飾與AD病理機制的關聯見圖2。

Figure 2.Association of m6A methylation with AD pathological mechanism.A： amyloid β-peptide （Aβ）； B： p-tau protein； C： microglial inflammation； D： loss of neurons and glial cells.圖2 m6A修飾與AD病理機制的關聯

2.1 m6A修飾參與Aβ的生成和降解 Aβ是淀粉樣蛋白前體蛋白（amyloid precursor protein， APP）先后通過β-和γ-分泌酶裂解切割獲得的多肽。β-分泌酶包含由β 位點的APP 裂解酶，切割APP，以產生附著有89 或99 個氨基酸片段的C 端膜；γ-分泌酶主要包括早老素1 或早老素2，將99 個氨基酸殘基的C 端膜結合片段進一步切割，產生Aβ1-40和Aβ1-42亞型，進而打破Aβ 的動態平衡，使其在腦實質沉積形成斑塊，最終導致細胞死亡和神經變性［28］。Zhao等［29］的研究表明，METTL3 過表達可降低具有神經毒性的Aβ 斑塊，減輕海馬錐體神經元氧化應激、突觸損傷和認知障礙，緩解AD。相反，Han 等［30］的研究顯示，在APP/PS1雙轉基因小鼠模型中，METTL3基因表達上調、FTO基因表達下調，海馬和皮層中m6A修飾增多，Aβ沉積顯著增高，加重AD 病理進程。Lu 等［31］的研究表明，在具有AD 病理特征的Tyrobp-/-模型小鼠中，海馬和皮層的小膠質細胞和星形膠質細胞中m6A 甲基轉移酶METTL3、METTL14 和WTAP 表達下調，導致突觸丟失和異常細胞周期，引發Aβ 增加，進而出現記憶障礙。此外，Yin 等［32］發現，單核巨噬細胞中的METTL3 缺失可減弱Aβ 誘導的AD 小鼠模型中DNA甲基轉移酶3A mRNA 中的m6A 修飾，進而損害YTHDF1 介導的DNA 甲基轉移酶6A 和α-微管蛋白乙酰轉移酶1 的翻譯以及微管蛋白的乙酰化，增強單核巨噬細胞遷移，加速Aβ 清除，緩解AD 的癥狀。綜合上述研究發現，甲基轉移酶METTL3 可能通過加重或減輕Aβ 沉積，進而對AD 病情產生雙向調節作用。

2.2 m6A參與AD 樣過度磷酸化τ蛋白病理 τ蛋白是微管狀神經元蛋白，微管結構域參與微管組裝的聚合和穩定，以維持細胞骨架的完整性［33］。細胞周期蛋白依賴性激酶5 過度活化可介導τ 蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化增加。過度磷酸化的τ 蛋白對微管的親和力降低，并相互扭曲形成成對的螺旋絲，積聚在細胞質、軸突和樹突中，最終形成神經原纖維纏結，影響信號轉導和細胞變性［34］。Jiang 等［35］的研究證明，在AD中，寡聚化τ蛋白/HNRNPA2B1/m6A復合物調控RNA 翻譯并促進應激顆粒的形成，持續積累導致不溶性復合物形成和神經毒性，HNRNPA2B1的下調阻止寡聚化τ 蛋白與m6A 結合，減少AD 誘導的 神 經 退 行 性 變。Shafik 等［36］將 敲 減METTL3、METTL14和YTHDF的果蠅與AD 果蠅進行雜交，該模型可特異性表達具有R406W 突變的人類基因，發現果蠅眼睛表型增強，提示m6A 修飾的缺失可增強τ蛋白磷酸化毒性。Huang 等［37］發現，在死后的AD 人腦中METTL3 與不溶性蛋白呈正相關的積累趨勢，這意味著在AD 中m6A 信號通路可能受到破壞，未來值得進一步深入研究。NOP2/Sun 結構域家族成員2（NOP2/Sun domain family member 2， NSun2）是哺乳動物腦內富集的非編碼RNA 的甲基轉移酶之一，Kim 等［38］的研究表明，在誘導的果蠅模型中，τ 蛋白毒性和磷酸化隨著NSun2 的下調而加劇，導致蛋白穩態的改變，加劇AD 的發生。Li 等［39］在三轉基因AD 小鼠模型中發現，FTO 通過靶向結節性硬化復合物1（tuberous sclerosis complex 1， TSC1）的mRNA，使TSC1 mRNA 去甲基化，降低其穩定性，進而加重mTOR 活化介導的τ 蛋白磷酸化，同時在高水平FTO環境下，AD 小鼠在莫里斯水迷宮實驗中表現出較低交替性、負分辨指數和較長逃跑潛伏期，而敲除FTO之后上述癥狀減輕，小鼠認知功能得到改善。

2.3 m6A 參與小膠質細胞活化介導的神經炎癥小膠質細胞是引發AD 的關鍵參與者，具有功能可塑性和促炎M1 與抗炎M2 雙重表型［40］。Aβ 聚集體通過獲得形態和分子變化誘導小膠質細胞活化，激活Toll 樣受體、CD36、CD14 和CD47，使白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）、IL-18、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）等炎癥因子和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3）炎癥小體表達激增，導致神經毒性增加和Aβ 斑塊清除減弱，加重AD［41］。Li 等［42］創建分化為促炎M1 樣（M1-L）、抗炎M2 樣（M2-L）和靜止或未刺激M0 樣（M0-L）三種表型的原代大鼠小膠質細胞模型，對m6A修飾的lncRNA和mRNA進行表觀轉錄組學微陣列和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）分析，發現87 個m6A 相 關 的lncRNA 在M1-L/M0-L 中 超 甲 基 化，在M2-L/M1-L 中低甲基化；同時M1-L/M0-L 中有9 個超甲基化的過表達mRNA 參與上調信號轉導、免疫系統處理和蛋白質降解等通路來調節小膠質細胞介導的神經炎癥。Ding 等［43］的研究顯示，甲基化閱讀蛋白IGF2BP1 通過m6A 修飾穩定促炎分子銅藍蛋白（ceruloplasmin， Cp）和鳥苷酸結合蛋白11（guanylatebinding protein 11， Gbp11）的mRNA，激活MAPK 和NF-κB 信號通路，引發小膠質細胞活化介導的炎癥反應。Zhou 等［44］發現，YTHDC1 可以維持沉默信息調節因子1 mRNA的穩定性，降低信號轉導器和激活轉錄因子3 磷酸化水平，導致M1 小膠質細胞標志物誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide， iNOS）和環加氧酶2（cyclooxygenase 2， COX2）以及炎癥因子TNF-α 表達下調，從而抑制小膠質細胞促炎表型M1 極化和遷移。在AD 中，脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導的神經炎癥可能會損害神經元遺傳信息的有效讀取，并導致AD 大腦中遺傳信息讀取的中斷［45］。Wen 等［46］采用LPS 構建原發性小膠質細胞炎癥模型，證實METTL3以m6A修飾依賴性方式促進TNF 受體相關因子6（TNF receptor-associated factor 6， TRAF6）/NF-κB信號通路激活，加重LPS誘導的小膠質細胞炎癥。

2.4 m6A修飾參與神經膠質細胞和突觸可塑性 參與神經系統的神經膠質細胞主要包含少突膠質細胞、NG2 膠質細胞、星形膠質細胞、衛星細胞、小膠質細胞、室管膜細胞和腸膠質細胞等，研究表明膠質細胞可以維持神經元附近的離子和神經遞質等穩態，同時協助負責細胞間信號傳導的神經系統軸突形成髓鞘，維持突觸功能，此穩態破壞可能會加速AD 等神經退行性疾病的進展［47］。Cockova 等［48］在AD 模型研究發現，鏈脲霉素（streptozotocin， STZ）處理的星形膠質細胞中m6A 去甲基化酶FTO 和m6A 閱讀器YTHDF1 表達水平升高，使用FTO 藥理抑制劑MO-I-500之后，膠質細胞原纖維酸性蛋白的表達降低，STZ處理的細胞存活率升高，線粒體功能障礙和生物能量紊亂得到改善，提示受干擾m6A 信號傳導可能通過損害星形膠質細胞生物能量學來加劇AD 病變。Wu 等［49］在少突膠質細胞中證實了一個新的m6A 閱讀器——富含脯氨酸卷曲螺旋蛋白2a（proline-rich coiled-coil 2a， Prrc2a）。Prrc2a 通過靶向下游基因Olig2 mRNA的GGACH編碼序列，以m6A依賴的方式增強Olig2 mRNA 的穩定性，促進少突膠質祖細胞增殖和高髓鞘化，為神經退行性疾病提供一種新的研究思路；同時這種作用可被m6A 去甲基酶FTO 消除，下調Olig2 mRNA 的m6A 修飾，并促進其降解。活性調節細胞骨架相關蛋白（activity-regulated cytoskeleton-associated protein， ARC）在記憶鞏固的突觸可塑性中發揮重要作用。Xu 等［50］在Aβ 誘導細胞模型中證實，METTL3 通過YTHDF1 依賴的m6A 修飾，介導ARC mRNA 的m6A及ARC蛋白表達升高，挽救Aβ誘導的ARC 表達減少，增強突觸可塑性，有助于AD 認知障礙的減輕。Castro 等［51］發現，在老年小鼠和AD患者中m6A 水平下降，導致鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII）和AMPA 選擇性谷氨酸受體1（AMPA-selective glutamate receptor 1， GluA1）轉錄本下調以及相應蛋白突觸翻譯減少，可能影響突觸功能和可塑性介導的衰老和AD相關認知能力的下降。

3 m6A修飾高通量測序揭示AD相關潛在分子靶標

隨著高通量測序分析與生物信息學的發展，已發現多種方法可以對AD 相關性m6A 修飾進行預測，主要包括液相色譜質譜聯用、比色法和高通量測序手段［包括m6A 測序、miCLIP （m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation）測序等］［52］。上述手段為m6A 修飾參與AD 病理機制提供更多研究證據。Deng等［53］利用高通量測序技術和功能富集分析，創新性發現m6A 讀取器蛋白IGF2BP2 在AD 患者中異常高表達并與細胞外基質受體和細胞因子受體相互作用。Han 等［30］在APP/PS1轉基因AD 小鼠模型中利用定量檢測RNA m6A修飾技術和高通量測序分析發現，小鼠皮層和海馬區的m6A 修飾和人類神經細胞重要調控因子AMPA受體結合蛋白甲基化程度增加，其中m6A 甲基轉移酶METTL3 表達上調，去甲基化酶FTO 表達下調；與此同時，KEGG 通路富集分析發現AD 小鼠腦樣本中谷氨酸突觸、軸突引導和鈣信號通路受mRNA m6A修飾的影響，提示在AD 中m6A 相關基因與突觸前膜、突觸后膜和突觸生長等相關。Li 等［54］從Gene Expression Omnibus 數據庫中下載了AD 患者與健康對照組腦組織切片全基因組RNA 數據，經m6A 測序技術和功能富集分析證實，HNRNPA2B1、YTHDF1、IGF2BP2A 和FTO 與AD 免疫細胞成分密切相關，m6A 修飾參與APP 相關因子的超甲基化和膠質細胞分化相關分子的低甲基化，可能成為調控AD 的關鍵環節。Zhang 等［55］對APP/PS1AD 模型小鼠進行了高通量測序，篩選出8 個差異表達circRNA m6A 基因，通過KEGG 通路結果分析circRNA m6A 修飾的改變與谷氨酸能、膽堿能和γ-氨基丁酸能突觸相關，表明circRNA的m6A修飾可能參與了AD的發病機制。

4 總結與展望

基于上述綜述，我們得知，m6A 作為表觀遺傳學網絡中的一類重要參與因子，與AD 發病機制密切相關，可參與AD 的診治過程，這已成為國內外相關研究的共識。其中通過介導Aβ 斑塊形成、τ 蛋白過度磷酸化及小膠質細胞活化介導的神經炎癥是m6A 修飾調控AD 的研究熱點，而針對AD 致病機制中的星形膠質細胞和突觸可塑性m6A 修飾的研究較少。m6A 修飾在AD 調控中的最新成果，闡述了m6A 修飾相關酶調控AD 的潛在分子機制，為AD 診治提供新的研究方向。同時，m6A 修飾的可逆性為AD 的早期干預提供了科學依據?；诙喾N生物技術的發展，包含m6A測序和miCLIP測序的高通量測序等相關方法可以測定與AD 發病機制相關的靶m6A 修飾基因，這對于未來尋求早期生物標志物和完成基礎實驗不可或缺。然而，m6A 與AD 相互作用的靶標研究目前正處于起步階段，體內外實驗和實際臨床診療之間是否存在一定差距，未來仍需提供科學的理論依據。