D-半乳糖誘導的衰老大鼠心臟S100A8/A9及相關炎癥通路基因表達的研究*

周 熒， 苑 婕， 呂東穎，2， 富丹婷， 蔡兆偉，2， 王德軍，2△

（1浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053；2浙江中醫藥大學中醫藥科學院動物實驗研究中心，浙江 杭州 310053；3浙江省中醫藥研究院實驗動物中心，浙江 杭州 310012）

隨著預期人均壽命的延長，當前大多數國家已進入老齡化社會，預計2050 年全球65 歲及以上的人口數量將超過20 億［1］。衰老是常見心臟疾病的主要危險因素，包括心力衰竭、動脈粥樣硬化和高血壓等［2］。衰老會導致心臟結構和功能的逐漸惡化，主要表現為心肌肥厚、心肌纖維化和心功能不全等［3-4］，最終導致心力衰竭等心臟疾病的患病率和死亡率顯著增加。因此，深入理解衰老對心臟的影響及作用機制對降低老年人心血管疾病的死亡風險具有重要意義。

目前研究認為，炎癥是心臟衰老的觸發因素［5］。累積的衰老細胞會分泌大量促細胞炎癥因子、蛋白酶和不溶性細胞外基質成分等衰老分泌相關表型（senescence-associated secretory phenotype， SASP），誘導周圍細胞衰老，形成促衰老炎癥微環境［6］。S100 鈣 結 合 蛋 白A8（S100 calcium-binding protein A8， S100A8）和A9（S100A9）是S100 家族的鈣結合蛋白，通常以S100A8/A9 異二聚體的形式存在，是慢性炎癥中重要的促炎介質［7］。據報道，小鼠發生心肌梗死等無菌性損傷后，S100A8和S100A9會作為警報素觸發或放大先天免疫通路而加劇炎癥，導致小鼠心臟損傷，形成惡性循環［8］。在患有嚴重心力衰竭的老年患者中S100A8/A9 可作為預測死亡率的生物標志物［9］。后續研究表明，S100A8/A9 與Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4， TLR4）結合能夠觸發髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）信號通路，導致核因子κB（nuclear factor-κB， NF-κB）激活和促炎細胞因子的分泌［10］。另外，S100A8/A9會與晚期糖基化終產物受體（receptor for advanced glycation end products， RAGE）結合使p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）和NF-κB 磷酸化激活［11］，促進心肌細胞功能障礙［12］和缺血后心力衰竭［13］。然而，S100A8/A9在大鼠衰老心臟發生中的作用目前尚未見報道。

本實驗采用頸背部皮下注射D-半乳糖（D-galactose， D-Gal）誘導大鼠心臟衰老模型，進行Morris 水迷宮實驗，檢測血清抗氧化酶活性、心臟功能、衰老標志基因表達以及組織病理學變化，采用轉錄組測序技術篩選大鼠心臟關鍵差異基因與通路，同時利用S100A8/A9 抑制劑帕奎莫德（paquinimod）進行體外驗證，明確S100A8/A9 及其介導的炎癥通路在大鼠心臟衰老發生中的作用，為預防和延緩心臟衰老提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與分組

8~10 周齡SPF 級雄性SD 大鼠12 只，體重220~250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司［SCXK（滬）2017-0005］，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心［SYXK（浙）2021-0012］。環境溫度（22±2） ℃，相對濕度50%~60%，12 h 明暗交替，自由飲食飲水。實驗經浙江中醫藥大學動物福利與倫理審查委員會批準（IACUC-20211220-06）。

適應性飼養1 周后將大鼠按體重隨機分為正常對照組（control組）和D-Gal組，每組6只。D-Gal組動物頸背部皮下注射D-Gal（150 mg/kg），每天一次，control 組采用相同方式注射等體積的生理鹽水，整個實驗周期為8 周［14］。實驗期間，觀察動物的飲食飲水、行為、毛色和精神狀況等一般情況。

2 主要方法

2.1 Morris 水迷宮實驗 7 周末，將大鼠頭朝池壁放入4 個象限之一。記錄大鼠找到水下平臺的時間（s），連續訓練5 天。最后一次獲得性訓練結束后的第2 天，將平臺撤除，開始60 s 的探查訓練。利用Morris 水迷宮系統（Panlab）記錄動物訓練時的逃避潛伏期和進入目標象限（原先放置平臺的象限）的次數，以此作為學習和空間記憶能力的檢測指標［15］。

2.2 超聲心動圖的測定 8 周末，用高分辨率小動物超聲影像系統（VisualSonics），在二尖瓣腱索水平記錄M 型超聲心動圖，計算射血分數（ejection fraction， EF）和短軸縮短率（fraction shortening， FS），在連續3個心動周期上測量各指標并取其平均值。

2.3 血清生化指標檢測 動物麻醉后，采用腹主動脈取血，室溫靜置30 min 后離心，取上清。根據超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、過氧化氫酶（catalase， CAT）和 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（均購自南京建成生物工程研究有限公司）說明書進行具體操作。

2.4 大鼠心臟病理形態學觀察 將大鼠心臟組織固定、脫水、包埋、切片后，進行常規HE 和Masson 染色。用顯微鏡圖像分析儀及ImageJ 圖像分析系統，觀察心肌細胞形態和心肌間質纖維化程度等情況。

2.5 細胞培養和處理 大鼠心肌細胞系H9C2購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，用含10%胎牛血清的DMEM 在37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養。實驗前，先將H9C2 細胞鋪板培養24 h，然后分為3 組：（1）control 組：DMEM 培養48 h；（2）DGal 組：10 g/L D-Gal 刺激48 h；（3）抑制劑組（D-Gal+paquinimod 組）：10 g/L D-Gal 和50 μmol/L paquinimod共刺激48 h［16］。用于后續實驗。

2.6 衰老相關β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase， SA-β-Gal）染色 SA-β-Gal染色試劑盒（20220314）購自北京索萊寶科技有限公司。將大鼠心臟冰凍切片或H9C2 細胞用SA-β-Gal 固定液固定15 min，PBS 清洗后，根據說明書配制染色工作液并將染液充分覆蓋組織或細胞，放入37 ℃無CO2培養箱過夜，在光學顯微鏡下觀察［16］。

2.7 二氫乙啶（dihydroethidium， DHE）染色檢測活性氧（reactive oxygen species， ROS）水平 DHE 試劑盒（20220317）購自凱基生物技術有限公司。將冰凍切片置于甲醇中固定1 min 后用流水沖洗，隨后滴加DHE 染料，37 ℃培養箱避光孵育30 min 后將染料洗去，DAPI 復染細胞核后，用VS120-S6-W 數字熒光掃描機進行掃描［17］。

2.8 透射電子顯微鏡觀察 快速切取一小塊心尖組織置于預冷的2.5%磷酸戊二醛緩沖液中，然后切成約1 mm×1 mm×1 mm 的小塊，4 ℃固定24 h。經常規脫水、浸泡、包埋、染色等工序，得到50~70 nm的超薄切片。使用H-7650型透射電子顯微鏡（HITACHI）觀察心肌超微結構。

2.9 轉錄組測序及分析 提取大鼠心肌組織總RNA 后，檢測所提RNA 的質量。待樣品質檢合格后，構建cDNA 測序文庫，使用HiSeq 4000 測序平臺（Illumina）進行高通量測序，文庫構建及測序工作由杭州聯川生物技術股份有限公司完成。采用edgeR軟件進行差異基因表達分析，篩選閾值為差異倍數（fold change， FC）≥1.5 且P<0.05。利用京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）數據庫對篩選出的差異表達基因進行KEGG通路富集分析。

2.10 qRT-PCR 驗證 采用Trizol 法提取大鼠心臟組織或H9C2 細胞總RNA 后，使用PrimeScript? RT Master Mix 試劑盒進行cDNA 合成。以GAPDH 作為內參照，利用ABI StepOne Plus 進行PCR 擴增。通過2-ΔΔCt法計算基因的相對表達水平。引物設計與合成均由上海生工生物工程有限公司完成，序列見表1。

表1 用于qRT-PCR的引物序列Table 1.Primer sequences for qRT-PCR

2.11 Western blot 根據全蛋白提取試劑盒說明書提取大鼠心臟組織或H9C2 細胞總蛋白并測定蛋白濃度。樣本離心加樣后開始電泳、電轉，封閉后加入相應Ⅰ抗，4 ℃下搖床孵育過夜。Ⅱ抗室溫孵育1.5 h后用Odyssey近紅外激光成像系統掃描條帶并進行分 析。 S100A8 抗 體（00102101）、S100A9 抗 體（00040992）和GAPDH 抗體（10027863）均購自Proteintech；p38 MAPK 抗體（9212S）、p-p38 MAPK 抗體（4631S）、NF-κB p65 抗體（8242S）和p-NF-κB p65 抗體（3033S）均購自Cell Signaling Technology。

2.12 S100A8/A9 免疫熒光染色 將脫完蠟的載玻片抗原修復和封閉后，分別滴加S100A8 和S100A9抗體（1∶1 000稀釋）于4 ℃孵育過夜。復溫后滴加Ⅱ抗，37 ℃孵育30 min。DAPI 封片后用熒光顯微鏡觀察。其中S100A8表達呈綠色熒光，S100A9表達呈紅色熒光，藍色熒光為細胞核。用Image-pro Plus 6.0軟件分析S100A8/A9陽性表達率。

3 統計學處理

所有數據以均數±標準差（mean±SD）來表示，組間均數比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。在線繪圖使用聯川生物云平臺（https：//www.omicstudio.cn/index）。作圖分析軟件包括GraphPad Prism 8.0、Image-Pro Plus 6.0和ImageJ。

結 果

1 D-Gal 對大鼠學習記憶能力和血清生化指標的影響

大鼠實驗流程如圖1A 所示。如圖1B 所示，隨著訓練天數的增加，兩組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短，但D-Gal組大鼠搜索平臺所需時間較control組更長，學習能力顯著下降（P<0.05 或P<0.01）。大鼠記憶能力檢測結果顯示，control 組大鼠搜索平臺具有方向性和目的性，但D-Gal組大鼠運動軌跡具有隨機性和邊緣性，并且D-Gal組大鼠跨越平臺所在象限次數顯著少于control 組（P<0.01），見圖1C、D。另外，DGal 組大鼠血清SOD 和CAT 活性均顯著低于control組（P<0.01），而血清MDA 含量雖有升高的趨勢但差異無統計學意義，見圖1E~G。

2 D-Gal對大鼠心臟功能和組織病理學的影響

心臟指數（心臟重量/體重）和心臟大小在D-Gal組和control 組大鼠之間無顯著差異，見圖2A、B。心臟超聲檢測結果表明，D-Gal 組大鼠EF 與FS 較control 組顯著降低（P<0.01），見圖2C、D。control 組大鼠心肌細胞界限分明，排列有序，未見明顯炎性改變；D-Gal 組心肌細胞排列紊亂，纖維斷裂，間質增大，可見炎性細胞浸潤，見圖2E。與control 組相比，D-Gal組大鼠心肌組織膠原纖維化面積顯著增加（P<0.01），見圖2F。control 組大鼠心肌幾乎沒有衰老細胞；而D-Gal 組大鼠心肌出現大片藍色陽性區域，見圖2G。衰老標志基因檢測結果顯示，D-Gal 組大鼠心肌CDKN1A、CDKN2A 和P53 的mRNA 表達水平較control 組均顯著升高（P<0.01），見圖2H。上述結果表明，D-Gal成功誘導大鼠心臟衰老模型。

Figure 2.Effects of D-galactose （D-Gal） on cardiac function and histopathological changes in rats.A： heart weight （HW）/body weight （BW） ratio （n=6）； B： heart morphological changes； C and D： left ventricular echocardiographic parameters， ejection fraction（EF） and fraction shortening（FS）， were measured（n=6）； E： representative images of HE staining in the myocardium（scale bar=100 μm； compared with control group， the cardiomyocytes of rats in D-Gal group were arranged disorderly and the fibers were broken）； F： cardiac sections stained with Masson（scale bar=100 μm； the red arrow indicates collagen fibrosis in myocardial tissue） and quantification of cardiac fibrosis in control and D-Gal groups； G： representative images of senescence-associated β-galactosidase（SA-β-Gal） staining in the myocardium（scale bar=100 μm） and quantitative analysis of SA-β-Gal activity in control and D-Gal groups （n=3）； H： the mRNA expression levels of CDKN1A， CDKN2A and P53 were detected by qRT-PCR （n=6）.Mean±SD.**P<0.01 vs control group.圖2 D-半乳糖對大鼠心臟功能和組織病理學的影響

3 D-Gal對大鼠心臟超微結構和ROS產生的影響

DHE 染色結果顯示，D-Gal 組大鼠心臟組織中ROS 水平顯著升高（P<0.01），見圖3A。進一步使用透射電子顯微鏡觀察心臟在超微結構變化，觀察到control 組大鼠心臟線粒體排列規整，基質致密且均勻，嵴分布良好，而D-Gal 組大鼠線粒體結構發生了明顯的改變，線粒體大小和形狀不均勻，內嵴破壞且部分丟失，見圖3B。

Figure 3.Effects of D-galactose （D-Gal） on rat heart ultrastructure and reactive oxygen species（ROS） production.A： Representative images of dihydroethidium （DHE） staining in the myocardium （scale bar=50 μm） and quantitative analysis of ROS activity in the myocardium of rats in the control group and D-Gal group （compared with control group， the ROS content in the hearts of rats in D-Gal group was significantly increased）； B： representative transmission electron micrographs （scale bar=1 μm； compared with control group， the rats in D-Gal group had abnormal cardiac mitochondrial morphology）.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group.圖3 D-半乳糖對大鼠心臟超微結構和ROS產生的影響

4 D-Gal誘導衰老大鼠心臟轉錄組分析

對兩組大鼠心臟進行轉錄組測序，最終篩選得到524個差異基因，其中220個基因顯著上調，304個基因顯著下調。在上述差異表達基因中，S100 家族成員S100A8和S100A9表達均顯著上調，見圖4A。KEGG 通路富集分析結果顯示，多個與S100 蛋白家族有關的通路，包括花生四烯酸代謝、IL-17 信號通路、MAPK 信號通路、NF-κB 信號通路和細胞衰老等炎癥通路被顯著富集（圖4B），提示S100A8/A9 介導的炎癥途徑可能參與D-Gal 誘導的大鼠心臟衰老過程。為證實測序結果的準確性，我們對S100A8 和S100A9 的mRNA 表達進行了qRT-PCR 驗證，結果與測序一致，見圖4C。Western blot 檢測從蛋白水平上也證實了表達趨勢一致性，即D-Gal 組大鼠心肌S100A8 和S100A9 蛋白表達水平均顯著高于control組（P<0.05），見圖4D。同時，免疫熒光染色結果顯示，S100A8/A9 主要在細胞質中表達，且D-Gal 組大鼠心肌組織S100A8/A9 表達水平較control 組顯著升高（P<0.01），見圖5A、B。

Figure 4.Transcriptome analysis of D-galactose（D-Gal）-induced aging rat heart.A： volcano plot of differentially expressed genes between the 2 groups； B： KEGG enrichment factor map； C： the mRNA expression of S100A8 and S100A9 was detected by qRT-PCR； D： Western blot analysis of S100A8 and S100A9.Mean±SD.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs control group.圖4 D-半乳糖誘導衰老大鼠心臟轉錄組分析

Figure 5.Expression analysis of in S100A8/A9 and its mediated MAPK/NF-κB pathway key factors.A and B： S100A8 and S100A9 immunofluorescence staining in the heart（scale bar=20 μm； the expression of S100A8 is green fluorescence， the expression of S100A9 is red fluorescence， and the blue fluorescence is the nucleus； n=3）； C： Western blot analysis of p-p38 MAPK， p38 MAPK， p-NF-κB p65 and NF-κB p65 （n=3）； D： the mRNA expression of IL-1β， IL-6 and TNF-α detected by qRT-PCR （n=6）.Mean±SD.*P<0.05， **P<0.01 vs control group.圖5 S100A8/A9及其介導的MAPK/NF-κB通路關鍵因子表達分析

5 S100A8/A9 及其介導的MAPK/NF-κB 通路關鍵因子表達分析

由于S100A8/A9 被認為通過p38 MAPK 信號促進NF-κB 活化，從而參與包括心臟毒性在內的多種炎癥反應，且上述KEGG 富集結果也顯示p38 MAPK和NF-κB 信號通路均被顯著富集，因此我們采用Western Blot 檢測兩組大鼠心臟組織p38 MAPK 和NF-κB p65 蛋白表達變化。如圖5C 所示，D-Gal 組大鼠心肌p38 MAPK 和NF-κB p65 蛋白磷酸化水平較control 組均顯著升高（P<0.05 或P<0.01）。進一步采用qRT-PCR 方法檢測關鍵炎癥因子的表達，結果顯示，白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）、IL-6 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）的mRNA 表達水平在D-Gal 組大鼠心臟組織中均顯著升高（P<0.01），見圖5D。

6 S100A8/A9 抑制劑paquinimod 對衰老心肌細胞的影響

與control 組相比，D-Gal 組SA-β-Gal 染色陽性H9C2 細胞顯著增多，衰老標志物CDKN2A 和P53 的mRNA 水平顯著上升，S100A8、S100A9、p-p38 MAPK和p-NF-κB 蛋白水平顯著升高（P<0.05 或P<0.01）；與D-Gal 組相比，經過paquinimod 處理抑制S100A8/A9 表達后，細胞SA-β-Gal 染色陽性面積和衰老標志物的mRNA 表達顯著減少，p-p38 MAPK 和p-NF-κB蛋白水平降低，且IL-1β、IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達水平顯著降低（P<0.05或P<0.01），見圖6。

Figure 6.Effects of S100A8/A9 inhibitor paquinimod on aging cardiomyocytes.A： representative images and quantitative analysis of senescence-associated β-galactosidase （SA-β-Gal） staining in cardiomyocytes （scale bar=100 μm； the red arrows indicate aging cardiomyocytes）； B and C： the mRNA xpression of CDKN1A， CDKN2A， P53， S100A8， S100A9， IL-1β， IL-6 and TNF-α detected by qRT-PCR； D： Western blot analysis of S100A8， S100A9， p-p38 MAPK， p38 MAPK， p-NF-κB p65 and NF-κB p65.Mean±SD.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs control group； #P<0.05， ##P<0.01 vs D-galactose （D-Gal） group.圖6 S100A8/A9抑制劑paquinimod對衰老心肌細胞的影響

討 論

本研究用D-Gal 誘導建立大鼠心臟衰老模型和H9C2 心肌細胞衰老模型，通過體內外實驗相結合探究S100A8/A9 對大鼠心臟衰老的影響。結果顯示，經D-Gal處理后的大鼠出現學習記憶功能障礙，血清SOD 和CAT 活性顯著下降，但MDA 含量卻沒有顯著差異。有研究報道，腹腔注射D-Gal（100 mg·kg-1·d-1）6周，行為學測試和生化指標并沒有顯示出差異，但持續注射至10 周時，出現空間記憶障礙且自由基濃度顯著增高［18-19］。另外，本研究D-Gal 組大鼠出現心臟功能障礙，但心臟指數并未發生明顯變化。研究表明，以400 mg·kg-1·d-1的劑量腹腔注射D-Gal 14周可降低心臟指數［20］，但其他研究表明，以150 mg·kg-1·d-1的劑量給Wistar 大鼠腹腔注射D-Gal 8 周可增加心臟指數［21］。可見，不同實驗所選用的造模劑量和造模時間存在差異，導致目前該模型建立和評價方面沒有統一標準。在本研究中，除上述指標外，我們輔以檢測SA-β-Gal 染色、CDKN1A/2A 和P53 等指標綜合評估大鼠心肌細胞衰老，觀察到D-Gal組大鼠心臟組織和H9C2 心肌細胞出現大量SA-β-Gal 陽性細胞積累，且CDKN1A、CDKN2A 和P53 的mRNA表達水平顯著升高，這與其他相關報道一致［22-23］。

作為損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns， DAMP）分子，S100A8/A9 在包括心臟疾病在內的多種疾病中的促炎作用已被證實。有研究報道，在缺血后心力衰竭小鼠模型中，S100A8/A9 與RAGE 結合后增加離體心肌NF-κB 和p38 MAPK 活性，促進心肌細胞炎癥［13］。Boyd 等［24］觀察到S100A9敲減可緩解脂多糖誘導的小鼠心臟功能障礙，并且其中和抗體給藥可防止NF-κB 激活、炎癥細胞浸潤、細胞因子產生以及血管緊張素II 輸注誘導的心臟肥大。另有研究表明，S100A8/A9 是TLR4內源性激活劑，它們與TLR4 結合后，可觸發細胞中特定信號通路，激活NF-κB 并激發促炎信號轉導，導致自分泌正反饋回路和炎癥因子上調的放大，最終造成組織損傷［25］，本研究結果與上述研究結果相似。本研究顯示，衰老大鼠心臟S100A8/A9 表達增加，p38 MAPK 和NF-κB 磷酸化水平顯著升高，其下游IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子表達也相應升高，這些信號級聯的激活可能會導致更多炎癥細胞因子和趨化因子的募集。另外，體外實驗進一步證實D-Gal能夠上調心肌細胞S100A8/A9 表達，并且藥物抑制S100A8/A9 則減輕心肌細胞衰老，降低p38 MAPK 和NF-κB 磷酸化水平以及IL-1β、IL-6 和TNF-α 等炎癥因子表達。由此可見，S100A8/A9 可能通過調控p38 MAPK/NF-κB 通路，以自分泌或旁分泌形式引起心臟慢性炎癥，進而導致心臟衰老的發生。

研究表明，S100A8/A9 能夠以Ca2+依賴性方式與花生四烯酸（arachidonic acid， AA）結合［26-27］。在細胞內，S100A8/A9 是AA 和NADPH 氧化酶之間的支架，與AA 結合后將其轉運至質膜激活NDAPH 氧化酶，進而產生ROS。研究表明，S100A9-/-小鼠嗜中性粒細胞的NADPH 氧化酶活性降低，導致ROS產生減少［28］。此外，S100A8/A9 的結合促進炎癥期間AA 跨細胞轉運。S100A8/A9-AA 復合物可能被炎癥灶處的浸潤細胞內化，用于合成炎癥介質，例如白三烯等，進一步促進炎癥［29］。在本研究中，AA 代謝通路在D-Gal大鼠心臟顯著富集，并且該組大鼠心臟線粒體損傷，ROS 產生增加，提示S100A8/A9 可能通過AA 代謝途徑介導炎癥從而導致大鼠心臟衰老發生。今后我們將采用靶向代謝組學方法檢測AA 及其代謝產物的變化，進一步明確S100A8/A9-AA 復合物在D-Gal誘導的心臟衰老中的作用。

綜上所述，注射D-Gal能夠成功誘導大鼠心臟衰老模型，該模型大鼠伴有學習記憶能力障礙、心臟結構和功能障礙以及氧化應激損傷。不止如此，S100A8/A9 可能通過p38 MAPK 和NF-κB 信號通路介導心肌細胞促炎因子分泌，參與D-Gal誘導的大鼠心臟衰老發生。