不同緯度來源結縷草葉片響應低溫脅迫的轉錄組分析

李雙銘,楊 勇,胡龍興,徐慶國*

(1.湖南工商大學,湖南 長沙 410205;2.長沙學院,湖南 長沙 410022;3.湖南農業大學,湖南 長沙 410128)

低溫是影響植物生長發育及其地理分布的重要環境限制因素之一。結縷草(Zoysiajaponica)屬于禾本科結縷草屬多年生草坪草種,廣泛分布在熱帶、亞熱帶和暖溫帶地區。作為暖季型草坪草其最適生長溫度為26℃～35℃,對低溫的適應能力相對較差,低于12℃時就會休眠,零下溫度常造成凍害[1]。因此,低溫是影響結縷草地理分布、草坪質量和推廣應用的主要限制因素。

秋冬季氣溫的降低,常誘導植物一系列基因的表達,從而使植株對冷凍的抗性增強[2]。轉錄組測序技術是探索生物基因總體表達水平的強有力工具[3]。當前,高通量轉錄組測序技術已在生物響應脅迫機制研究中得到普及應用,一大批植物涉及防御、物質運輸、信號轉導及次生代謝的基因得到鑒定,對于揭示植物的抗逆機制起了很大的推動作用[4-5]。

結縷草喜溫暖濕潤氣候,具有較強的耐熱性,抗寒性較差,但不同地理來源的結縷草由于其遺傳背景的不同而耐寒性差異較大,研究不同地理來源結縷草的低溫脅迫生理,對擴大其栽培區域具有重要的理論意義和實踐應用價值。前人大多只從冷害處理或凍害處理方面進行了低溫脅迫下的生理響應研究,但多個連續低溫處理的研究國內外報道較少,而自然界草坪草在秋冬季常處于一個逐漸從最適生長溫度、亞適溫、冷害和凍害逐漸降溫的過程。本試驗以采自我國不同緯度來源的結縷草為材料,采用轉錄組測序(RNA-Seq)技術,分析不同緯度來源結縷草種質響應冷害和凍害脅迫的基因表達特性,結合生物信息學分析,以期挖掘和分析與結縷草耐寒性相關基因,為深入解析結縷草耐寒分子機制以及選育耐寒結縷草品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養

本試驗根據前期研究結果[6],選擇兩個不同緯度來源的結縷草基因型為材料,分別為結縷草ZG-36(來源于遼寧,緯度40°18′、經度123°34′)和ZG-32(來源于廣東,緯度22°53′,經度112°16′)。

材料于2021年4月分別用草莖擴繁種植于湖南農業大學草業科學系試驗基地。2021年7月,選取致密性好的草皮塊并去除根部部分泥土,種植于裝填了1.2 kg河沙和市售花土(1∶1,v/v)混合基質的塑料盆中。塑料盆的上口徑為18 cm、下口徑15 cm、高20 cm。每個種質材料種植12盆(3個處理×4次重復),放置于湖南農業大學草業科學系教學科研試驗基地玻璃溫室中培養。根據土壤基質水分狀況及時補充水分以保持盆栽土壤濕潤,每3 d修剪一次保持其冠層高度約為5 cm,每星期每盆澆1/2 Hongland營養液200 mL。

1.2 試驗設計與處理

材料在溫室中培養約45 d待其冠層基本建成后,將各盆栽材料轉入人工氣候箱中按圖1所示進行梯度降溫處理。(1)適溫處理(OP)：初始溫度30℃/25℃(晝/夜)處理5 d。(2)冷害處理(CH)：經適溫處理的材料再在8℃/2℃(晝/夜)處理5 d。(3)凍害處理(FR)：經適溫和冷害處理的材料再轉入溫度設為2℃/-4℃的氣候箱中處理5 d。人工氣候箱相對濕度設為65%～75%,12 h光照時間和500 μmol·m-2·s-1的光照強度。各處理均設4次重復(4盆),在各梯度降溫處理結束時,每盆取植株功能葉片混勻,用于各處理的轉錄組測定分析。

圖1 溫度處理及取樣時間示意圖Fig.1 The schematic diagram for the temperature treatments and sampling date

1.3 RNA提取和cDNA文庫構建

采用Trizol法提取結縷草總RNA,經DNae I去除DNA后,取2 μL的RNA樣品用NanodropTMOne/One C測定樣品的OD260/OD280比值,然后用1.0%的瓊酯糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,最后用QubitTM試劑盒測定RNA的含量。取2 μg總RNA采用KCTMStranded mRNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒進行測序文庫構建(Catalog NO.DR08402)。使用帶有Oligo(dT)的磁珠富集細胞的成熟mRNA,然后將mRNA打斷成短的片段,再利用逆轉錄酶反轉錄產生cDNA,最后利用Hiseq2500高通量測序儀進行測序,測序工作委托北京諾禾致源科技股份有限公司的高通量測序平臺進行。

1.4 轉錄組測序及拼接組裝

對測序所獲得的原始數據,首先用Trimmomatic軟件(version 0.36)進行接頭過濾和去掉低質量的序列(Q值<20),獲得高質量的有效讀長(clean reads)并進行后續分析。

應用Trinity軟件對有效數據(clean data)進行從頭(de novo)拼接組裝,再采用RSeQC軟件去除轉錄本中的冗余序列,得到非冗余通用基因(universal gene,unigene)。

1.5 測序數據的分析與功能注釋

采用BLAST軟件,在NCBI的non-redundant(NR),UniProt/Swiss-Prot,Gene Ontology(GO),KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes)等數據庫進行比對,并進行差異基因(Differentially expressed genes,DEGs)的功能注釋、GO及KEGG分析。差異基因的篩選條件為P-value≤0.01,|log2Fold Changes |≥1。其中,Fold Changes代表不同處理之間基因表達量的比值。該值大于1時,則該基因認定為上調表達;反之,則為下調表達。

1.6 差異表達基因的qPCR驗證

為確保試驗結果的真實性與有效性,隨機挑選10個基因對轉錄組測序結果予以驗證,并利用Primer 5.0 軟件設計擴增引物(表1),采用qPCR的方法,對其表達水平進行驗證。依據Fermentas cDNA synthesis將RNA反轉錄合成cDNA。依照TaKara公司的SYBR System操作手冊,使用ABI7500型PCR儀進行PCR擴增。其反應程序設定為95℃預變性30 s,95℃ 5 s,52℃～55℃ 20 s,40個循環,每個處理設置3次重復。將所得CT值,使用2-△△CT法依次計算出不同處理下目標基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序質量評價及denovo組裝分析

對兩個不同緯度來源結縷草種質在低溫脅迫下的葉片進行了轉錄組測序。如表2所示,在低緯度來源結縷草種質ZG-32中共獲得160 721 526條原始讀序和24.1Gb原始數據;在高緯度來源結縷草種質ZG-36中共獲得180 156 874條原始讀序和27.02 Gb原始數據,經去掉含有帶接頭和低量的序列后,在ZG-32中共獲得147 849 938條有效讀序和21.62 Gb有效數據,在ZG-36中共獲得170 849 182條有效讀序和25.09 Gb有效數據。所獲得的序列中的GC含量為52%～55%,Q30(測序錯誤率小于0.1%)堿基百分比均為99%以上,測序獲得的數據準確可靠。

表1 試驗所用基因及其引物序列Table 1 Gene and primer sequence used in the experiment

用Trinity軟件對有效讀序進行denovo拼接組裝,共獲得298 364條轉錄本,最大長度為17 536 bp,平均長度為864.7 bp,N50長度為1 414 bp,對Trinity拼裝得到的轉錄本去除冗余,共獲得196 343條單一基因,平均長度為666.4 bp,N50長度為1 004 bp,組裝質量較好(表3)。

2.2 單一基因的功能注釋

如表4所示,利用七大數據庫進行了基因功能注釋,共注釋到了237 128個基因,在Uniprot,NR,Pfam,Rfam,eggNog,GO和KEGG數據庫中分別注釋到了188 911,187 679,193 999,35 400,171 745,136 990和48 576個基因,分別占注釋基因總量的79.6%,79.1%,81.8%,14.9%,72.4%,57.8%和20.5%。

表2 測序質量評價Table 2 Evaluation of the sequencing results

表3 組裝結果分析Table 3 Analysis of assembly

表4 單基因序列注釋統計表Table 4 Unigene function annotated

2.3 差異表達基因層次聚類分析

由圖2可知,根據ZG-36與ZG-32兩個結縷草種質在不同低溫處理下基因的表達模式可分為3大組,每大組又可分為兩小類。I大組中主要為在凍害條件下的ZG-36或ZG-32結縷草種質中的基因表達量高,而在常溫對照和冷害條件下的ZG-36或ZG-32結縷草種質中的基因表達量低的一類;II大組中主要為在冷害條件下的ZG-36或ZG-32結縷草種質中的基因表達量高,而在常溫對照和凍害條件下的ZG-36或ZG-32結縷草種質中的基因表達量低的一類;III大組中則主要為在常溫對照條件下的ZG-36或ZG-32結縷草種質中的基因表達量高,而在冷害和凍害條件下的ZG-36或ZG-32結縷草種質中的基因表達量低的一類。

圖2 結縷草種質低溫脅迫處理的基因表達層次聚類圖Fig.2 Hierarchical clustering of gene expression in Zoysia germplasms under low temperature stress注：紅色表示高表達基因;藍色表示低表達基因Note：The red indicates highly expressed genes;the blue low expressed genes

2.4 差異表達基因維恩圖分析

通過維恩圖對單個結縷草種質組內的3個比較組間的所有差異表達基因進行了集合展示。如圖3所示,在高緯度來源種質ZG-36中,其3個比較組間共同差異表達的基因有343個,占其差異表達基因總數的5.7%,在各比較組內特異表達的基因數分別為669,596和384個,分別占其總數的11.1%,9.9%和6.4%(圖3a);在低緯度來源的結縷草種質ZG-32中,其3個比較組間共同差異表達的基因為153個,占其差異表達基因總數的3.1%,在各比較組內特異表達的基因數分別為2 146,162和83個,分別占其總數的43.1%,3.3%和1.7%(圖3b)。

圖3 相同結縷草種質內不同溫度處理下差異表達基因的維恩圖Fig.3 The Venn map of differentially expressed genes within the same Zoysia Germplasm under different temperature treatments注：a為ZG-36,b為ZG-32Note：Panel a,ZG-36;Panel b,ZG-32

如圖4所示,與常溫對照相比,冷害溫度下在ZG-32和ZG-36兩個結縷草種質中共有4 997個差異表達基因,其中在ZG-32有3 690個差異表達基因;在ZG-36中有2 957個差異表達基因,在ZG-32和ZG-36間共同表達的差異基因有1 650個,其特異表達的差異基因分別為2 040和1 307個;凍害條件下在ZG-32和ZG-36中共有5 163個差異表達基因,其中ZG-32有2 394個,ZG-36有4 407個,在ZG-32和ZG-36間共同表達的差異基因有1 639個,其特異表達的差異基因分別為755和2 768個。

圖4 相同溫度處理下不同結縷草種質間差異表達基因的維恩圖Fig.4 The Venn map of differentially expressed genes in different Zoysia under the same temperature treatment 注：a為冷害,b為凍害Note：Panel a,chilling;Panel b,freezing

2.5 差異表達基因GO功能分類及富集分析

由圖5可知,在冷害低溫下,來自低緯度的結縷草種質ZG-32葉片差異表達基因在生物學過程(Biological process,BP)、細胞組分(Celluar component,CC)與分子功能(Molecular function,MF)等3大分類中均有富集,但富集程度均不一樣。在上調基因中,在BP分類下富集程度高的為色氨酸代謝過程、天門冬氨酸生物學合成與代謝過程、離子轉運和膜脂代謝過程,而在CC分類下僅有質膜組分富集;在MF分類下富集程度高的主要有磷跨膜轉運子活性、糖苷轉移酶活性、乙酰轉移酶活性和分子內裂解酶活性(圖5a)。在下調基因中,在BP分類下富集程度高的為光合作用的光反應、花發育與生殖發育、蛋白自磷酸化和絲氨酸生物學合成等過程;在CC分類下富集的有類囊體、微體膜和過氧化物體膜;在MF分類下主要富集的有NADH脫氫酶活性、微管結合、磷脂結合和離子通道活性(圖5b)。

由圖6可知,在凍害脅迫下,ZG-32的葉片差異表達基因在BP,CC和MF等3大分類中均有富集。在上調基因中,在BP分類下富集程度高的為光合作用光反應、光與紫外線剌激、非生物逆境剌激和芳香氨基酸代謝;在CC分類下富集的有離子通道復合體、甲基化轉移酶、質膜蛋白復合體、跨膜轉運復合體;在MF分類下富集的種類最多,主要有Ubiquitin特異蛋白酶活性、電子載體活性、離子通道活性、跨膜轉運活性等(圖6a)。在下調基因中,在BP分類下富集程度高的有多細胞生物體穩態、蛋白修復、光系統II修復、光合作用聚光過程等;在CC分類下富集的組分有光系統II、DNA包裝復合體、類囊體和光合膜;在MF分類下主要富集的有氨基糖苷乙酰基轉移酶、酸性氨基酸連接酸、輔酶A水解酶和磷跨膜轉運子活性(圖6b)。

圖6 凍害脅迫下結縷草種質ZG-32 FR Vs OP差異表達基因GO功能分類富集圖Fig.6 The map of the classification and enrichment of the GO function of the differential expression genes in ZG-32 germplasm FR Vs OP under freezing stress

由圖7可知,在冷害脅迫下,高緯度來源結縷草種質ZG-36的差異表達基因在BP,CC和MF等3大分類中均有富集,但富集的組分種類和程度均不一樣。在上調基因中,在BP分類下富集程度高的為響應外界剌激、多糖代謝過程、離子穩態、脂轉運與定位、光合作用、碳水化合物代謝等過程;在CC分類下富集的僅有葉綠體和細胞外圍組分;在MF分類下富集的種類最多,富集程度也較高,主要有組蛋白甲基轉移酶活性、賴氨酸甲基轉移酶活性、磷跨膜轉運子活性、離子通道活性和鈣調素結合活性等分子功能(圖7a)。在下調基因中,BP分類下富集的組分最多,富集程度較高的主要有晝夜節律、生物向性、分子功能的負調控、催化活性的負調控、硫氨酸生物學合成等過程;在CC分類下富集的組分較少,僅有過氧化物體和微體兩個組分;在MF分類下主要富集的有嘌呤跨膜轉運子活性、脂酶活性、蛋白二聚與結合活性等分子功能(圖7b)。

圖7 冷害脅迫下結縷草種質ZG-36CH Vs OP差異表達基因GO功能分類富集圖Fig.7 The map of the classification and enrichment of the GO function of the differential expression genes in ZG-36 germplasm CH Vs OP under chilling stress

由圖8可知,在凍害脅迫下,ZG-36的差異表達基因在BP,CC和MF 3大分類中均有富集。在上調表達基因中,在BP分類下主要富集與離子運輸、硫復合物代謝、細胞呼吸、氨基酸代謝、蛋白代謝和有機酸代謝等過程相關的基因;在CC分類下富集程度高的僅有呼吸鏈復合體和線粒體呼吸鏈復合體兩個組分;在MF分類下富集程度高的主要有細胞色素C氧化酶活性、電子載體活性、脂酶活性、離子結合活性等分子功能(圖8a)。在下調基因中,BP分類下富集程度高的主要有無機離子轉運、催化活性的負調控、含硫氨基酸生物學合成、陰離子運輸、氧化還原酶代謝等過程;在CC分類下富集程度高的有微體、微體膜、細胞皮層等組分;在MF分類下富集程度高的主要有轉移酶活性、脂酶活性、陰離子跨膜轉運活性等分子功能(圖8b)。

圖8 凍害脅迫下結縷草種質ZG-36 FR Vs OP差異表達基因GO功能分類富集圖Fig.8 The map of the classification and enrichment of the GO function of the differential expression genes in ZG-36 germplasm FR Vs OP under freezing stress

2.6 Unigene的KEGG代謝通路富集分析

對兩個不同緯度來源結縷草種質ZG-32和ZG-36在冷害和凍害脅迫下差異表達的基因進行了KEGG代謝通路富集分析。由圖9可知,在冷害脅迫下,ZG-32葉片上調表達差異基因顯著富集的前20條代謝通路中,富集系數和成員最多的分別為植物激素信號轉導、苯丙素生物合成和類黃酮生物合成等代謝通路;其次為玉米素生物合成、淀粉和蔗糖代謝、氨基酸生物合成等代謝路徑(圖9a)。在下調表達差異基因顯著富集的前20條代謝通路中,富集成員和系數最多的為光合作用、碳固定與代謝、氧化磷酸化等代謝途徑;其次為植物激素信號轉導、苯丙素生物合成、氨基酸生物合成等代謝通路(圖9b)。

圖9 冷害脅迫下結縷草種質ZG-32 CH Vs OP差異表達基因KEGG代謝通路富集分析Fig.9 Analysis of KEGG metabolic pathway enrichment of the differential expression genes in ZG-32 germplasm CH Vs OP under cold stress

由圖10可知,在凍害脅迫下,ZG-32葉片上調表達差異基因顯著富集的前20條代謝通路中,集中富集在氧化磷酸化、信號轉導途徑、細胞周期、核糖體和剪切體等代謝通路(圖10a);在下調基因顯著富集的前20條代謝通路中,富集成員和系數較多的為植物激素信號轉導、苯丙素生物合成、淀粉與蔗糖合成、玉米素合成和類胡蘿卜素合成等代謝通路,其次為丙酮酸代謝、光合作用、半乳糖代謝、脂肪酸代謝等代謝通路(圖10b)。

由圖11可知,在冷害脅迫下,ZG-36的葉片上調表達差異基因顯著富集的前20條代謝通路中,富集系數和成員最多的為植物激素信號轉導、苯丙素生物合成、類黃酮生物合成和光合作用等代謝通路,其次為淀粉和蔗糖代謝、胡蘿卜素生物合成和脂類代謝等代謝通路(圖11a);在下調表達差異基因顯著富集的前20條代謝通路中,富集成員和系數最多的為光合作用、光合碳固定與代謝、苯丙素生物合成等代謝通路,其次為氨基酸生物合成、類黃酮生物合成、丙酮酸代謝、果糖和甘露糖代謝等代謝通路(圖11b)。

圖10 凍害脅迫下結縷草種質ZG-32 CH Vs OP差異表達基因KEGG代謝通路富集分析Fig.10 Analysis of KEGG metabolic pathway enrichment of the differential expression genes in ZG-32 germplasm FR Vs OP under freezing stress

由圖12可知,在凍害脅迫下,ZG-36葉片上調表達差異基因顯著富集的前20條代謝通路中,富集系數和成員最多的為AMPK信號途徑通路,其次為cAMP信號途徑、鞘脂代謝與信號途徑、內質網蛋白加工、剪切體和膽堿代謝等代謝通路(圖12a);在下調基因顯著富集的前20條代謝通路中,富集成員和系數最多的為光合作用、光合碳固定與代謝、植物激素信號轉導和苯丙素生物合成等代謝通路,其次為氨基酸生物合成、谷胱甘肽代謝、丙酮酸代謝、果糖與甘露糖代謝、苯丙氨酸代謝等代謝通路(圖12b)。

圖11 冷害脅迫下結縷草種質ZG-36 CH Vs OP差異表達基因KEGG代謝通路富集分析Fig.11 Analysis of KEGG metabolic pathway enrichment of the differential expression genes in ZG-36 germplasm CH Vs OP under chilling stress

圖12 凍害脅迫下結縷草種質ZG-36 CH Vs OP差異表達基因KEGG代謝通路富集分析Fig.12 Analysis of KEGG metabolic pathway enrichment of the differential expression genes in ZG-36 germplasm FR Vs OP under freezing stress

2.7 差異表達轉錄因子統計分析

轉錄調節是植物在正常或逆境條件下生長過程的關鍵過程,轉錄因子(Transcription factor,TF)在此過程中具有重要作用。如圖13所示,低溫脅迫后ZG-32和ZG-36兩個不同緯度來源結縷草種質中有9 281個轉錄因子注釋到TFs數據庫,涵蓋了50個TFs家族,其中AP2,bZIP,bHLH,WRRKY,ERF和TALE等轉錄因子家族在該兩個結縷草種質中占較高比例。

如表5所示,在能夠注釋到TFs數據庫的50個轉錄因子家族中有38個TFs家族在兩個不同緯度來源結縷草種質ZG-36或ZG-32中差異表達,其中差異表達數量最多的為bHLH,ERF,MYB,ARF,bZIP等幾大類。在差異表達的38個TFs家族中,ZG-36有22個TFs家族,其差異表達的成員數量多于ZG-32,如bHLH,ERF,MYB,bZIP,G2-like,HD-ZIP,Dof,HSF和GRAS等,表明這些差異表達的轉錄因子可能對增強來自高緯度地區結縷草種質ZG-36的耐寒性起到了重要的調控作用。

圖13 轉錄組中注釋到的轉錄因子Fig.13 Transcription factors annotated in transcriptome

表5 差異表達的轉錄因子家族統計Table 5 Statistics on the families of differentially expressed transcription factors

2.8 差異表達的LEA基因分析

植物胚胎發育晚期豐富蛋白(Late embriogenesis abundant protein,LEA)是植物應對冷凍、鹽堿、干旱等失水脅迫逆境而廣泛存在的一種親水性應答蛋白,它具有較強的熱穩定性。如表6所示,冷害或凍害脅迫下,ZG-36和ZG-32兩個基因型葉片中共篩選獲得了31個差異表達LEA基因。其中,冷害下在ZG-36中上調表達21個,下調表達僅1個;在ZG-32中上調表達14個,下調表達8個。凍害下在ZG-36中上調表達18個,下調表達僅2個;在ZG-32中上調表達7個,下調表達13個。表明冷害和凍害條件下,在ZG-36中上調表達的LEA基因數量顯著多于ZG-32的LEA基因數量;而在ZG-32中下調表達的LEA基因數量卻顯著多于ZG-36,進一步表明LEA基因對不同結縷草種質適應低溫脅迫及增強其耐寒性起了非常重要的作用。

2.9 差異表達基因的qPCR驗證

如圖14所示,以冷害和凍害處理后的ZG-36和ZG-32兩個結縷草葉片為材料提取RNA,反轉錄合成cDNA后為模板,隨機選取了10 條差異表達基因進行qRT-PCR驗證,其基因表達量變化趨勢與轉錄組測序結果大致相同,其線性回歸方程為y=1.119x-0.378 8(R2=0.889),表明這兩組數據相關性和轉錄組測序結果置信度較高。

表6 差異表達的LEA基因分析Table 6 Analysis of differentially expressed late embryogenesis abundant protein genes

圖14 qPCR驗證RNA-seq數據Fig.14 qPCR validated with RNA-seq data

3 討論

結縷草廣泛分布于世界熱帶、亞熱帶和暖溫帶地區,在我國分布北至東北的遼寧、吉林,南至華南的廣東、海南等地。不同緯度來源的結縷草種質其對低溫的適應性不同,前期以及本研究結果均表明低緯度來源的結縷草種質對低溫較為敏感且其耐寒性弱,而高緯度來源的結縷草種質則耐寒性強[6]。

通過轉錄組測序技術對基因表達進行分析,可獲取細胞內的基因表達全局圖,從而有助于解析植物脅迫相互作用的抗性機制,是當前用于植物抗逆機制研究的有力手段[7-8]。為此,本研究基于來自高緯度來源結縷草ZG-36和低緯度來源結縷草ZG-32對低溫敏感性的差異,對其在冷害和凍害處理下葉片轉錄組進行分析。與正常溫度處理相比較,冷害脅迫下耐寒性弱且來自低緯度地區的結縷草種質ZG-32中差異表達的基因數量顯著多于ZG-36的基因數量,而在凍害脅迫下ZG-36中差異表達的基因數量顯著多于ZG-32基因數量,表明不同地理緯度來源的結縷草種質在基因表達層面對低溫脅迫的響應時間不一樣,低緯度來源結縷草種質ZG-32對低溫響應敏感,以較早的響應低溫以誘導一系列基因的表達而提高適應性,其耐寒性弱;而高緯度來源結縷草種質ZG-36則對低溫適應性強,其響應速度較慢,耐寒性強。并且在凍害條件下高緯度來源結縷草種質ZG-36響應低溫脅迫的基因表達數量多,有利于提高其抗凍性。

KEGG代謝通路分析結果表明,植物在冷害下激素信號轉導、類黃酮生物合成、淀粉與蔗糖代謝、苯丙素生物合成等通路在ZG-36與ZG-32兩個不同緯度來源結縷草葉片上調表達基因中均顯著富集,表明零上低溫誘導了植物激素中ABA,JA,SA的生物合成與信號轉導,從而啟動下游基因的表達而提高其耐寒性,增強其適應性[9-10]。此外,冷害也誘導了次生代謝產物代謝通路如類黃酮的生物合成,在耐寒性強且來自高緯度的ZG-36中還誘導了胡蘿卜素和脂類的代謝,可提高其細胞膜脂的穩定,從而增加其對低溫脅迫的抵御能力[11-13]。ZG-36與ZG-32兩個不同耐寒性結縷草種質的光合作用、光合碳代謝、丙酮酸代謝等代謝通路在冷害和凍害脅迫下的下調表達差異基因中富集,表明低溫脅迫影響了結縷草的光合作用和二氧化碳的固定,這與前期的研究結果相一致[14]。

轉錄因子調控植物中與脅迫相關基因的表達,對植物應對低溫脅迫等具有重要作用[15]。在本研究中,ZG-36與ZG-32兩個不同耐寒性結縷草種質的差異表達基因功能注釋發現,差異表達基因在分子功能和生物學過程中富集最多,涉及差異表達的轉錄因子達38個家族,其中來自高緯度的ZG-36中有22個TFs家族,其差異表達的成員數量多于低緯度來源的ZG-32,主要有bHLH,ERF,MYB,bZIP和HSF等,這些轉錄因子是植物中重要的轉錄因子家族之一,所有家族成員對植物抗逆有著非常重要的作用。枇杷ERF基因EjERF39可與EjMYB8共轉錄激活Ej4CL1表達從而提高枇杷的耐寒性[16];獨行菜和蘋果bHLH類轉錄因子LaICE1和MdbHLH3在低溫脅迫下可顯著誘導表達而提高耐寒性[17];過表達蒙古冰草MwMYB4和蘋果MdMYB2可顯著提高擬南芥的耐寒性[18-19]。枇杷HSF轉錄因子EjHSF1和EjHSF3可激活EjHsp和木質素合成相關基因的表達從而提高枇杷的耐寒性[20];棉花bZIP轉錄因子Ghb,ZIP15和甘藍型油菜bZIP轉錄因子在響應低溫脅迫而增強了植株的耐寒性[21,22]。上述研究結果表明,這些差異表達的轉錄因子可能在高緯度來源結縷草種質ZG-36的低溫適應性和抗凍性中起了重要的調控作用。

為抵御外界脅迫對機體造成的可能損害,逆境下的植物機體通過誘導產生相應的功能蛋白來適應外部環境變化,從而提高自身逆境適應能力,其中LEA被認為是一類與植物抵御非生物脅迫密切相關的蛋白[23-28]。在擬南芥中過表達陸地棉GhLEA3基因,顯著提升了擬南芥種子在低溫的萌發率,提高了耐寒性[29];過表達天麻LEA基因可提高大腸桿菌耐寒性[30];玉米ZmLEA3基因編碼的蛋白能保護低溫脅迫下的乳酸脫氫酶活性,過表達ZmLEA3可顯著提高轉基因煙草、酵母和大腸桿菌的耐低溫能力[31];閆逢英等[32]克隆了結縷草LEA基因ZjLea3,轉基因酵母抗逆性分析結果顯示轉化基因的酵母細胞對冷凍的耐受能力顯著提升,表明ZjLea3蛋白參與結縷草抵御低溫非生物脅迫的調控。在本研究中,冷害或凍害下,ZG-36與ZG-32兩個不同耐寒性結縷草種質的葉片中共篩選獲得了31個差異表達的LEA基因,并且在耐寒性強且來自高緯度地區的結縷草種質ZG-36中上調表達的LEA基因數量顯著多于耐寒性弱且來自低緯度地區的結縷草種質ZG-32;而在ZG-32中下調表達的LEA基因數量卻顯著多于ZG-36,表明LEA基因對結縷草適應低溫脅迫和增強耐寒性起了非常重要的作用。

4 結論

綜上所述,通過轉錄組測序分析表明來自低緯度的結縷草種質ZG-32對低溫脅迫響應敏感,耐寒性弱,以較早的響應低溫誘導一系列基因的表達而提高適應性;而來自高緯度的結縷草種質ZG-36則對低溫適應性強,響應速度較慢,耐寒性強。此外,高緯度來源種質ZG-36具有較強的耐寒性還與其在低溫脅迫下誘導表達的基因數量密切相關,尤其是與植物激素信號轉導、胡蘿卜素和脂類的代謝等次生代謝產物代謝通路、轉錄因子(bHLH,ERF,MYB,bZIP,HSF等)和LEA蛋白的表達相關,從而提高了ZG-36細胞膜的穩定性及增強其對低溫的適應性和抵御能力。