基于GAS5/miR-21介導的細胞增殖探討心康沖劑抗心力衰竭大鼠心肌纖維化的作用機制

劉蓉芳 ，郭冰 ，余意 ，李園 ，王敏

1.暨南大學附屬江門市五邑中醫院，廣東 江門 529000；2.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙 410208

心肌纖維化是心肌結構重塑的重要特征[1]，而心肌成纖維細胞（CFs）異常增殖是心肌纖維化開始和發展的關鍵步驟。miR-21被認為是許多心臟疾病如慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）的預測和診斷指標[2]。研究發現，miR-21通過靶向抑制磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）增強PI3K/Akt通路活性，促進CFs增殖而導致心肌纖維化[3]。生長阻滯特異性轉錄本5（GAS5）是一種控制細胞增殖和生長的長鏈非編碼RNA，可通過調控miR-21表達使PTEN表達增加[4]，通過抑制周期蛋白D1（CyclinD1）和周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）表達抑制細胞增殖[5]。而目前從調控GAS5/miR-21介導細胞增殖角度研究中醫藥抗心肌纖維化的報道較少。

心康沖劑是全國名老中醫毛以林教授治療CHF的經驗方。前期研究發現，心康沖劑可抑制miR-21 表達，通過調控PTEN/Akt通路逆轉心肌纖維化[6-7]，但其對GAS5表達及成纖維細胞增殖的調控作用尚不明確。本研究通過觀察心康沖劑對CHF 大鼠GAS5、miR21、PTEN基因表達及CFs增殖的影響，進一步探討其抗心肌纖維化的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

5 周齡SPF 級SD 大鼠46 只，雌雄各半，體質量（170±10）g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心SPF 級動物房，溫度（22±2）℃，相對濕度50%±10%，每日光照12 h，自由攝食飲水，標準飼料喂養。本實驗經湖南中醫藥大學動物倫理委員會審批（LLBH-202105180002）。

1.2 藥物及制備

心康沖劑（黃芪30 g，人參10 g，升麻5 g，柴胡5 g，桔梗5 g，茯苓15 g，陳皮10 g，麩炒白術10 g，薏苡仁30 g，砂仁6 g，制附片10 g，桂枝10 g，生姜皮10 g，大腹皮10 g），由湖南中醫藥大學第二附屬醫院中藥制劑室制成干燥顆粒，10 g顆粒相當于原藥材3.38 g。纈沙坦膠囊，北京諾華制藥有限公司，批號X2925，80 mg/粒。注射用鹽酸阿霉素，深圳萬樂藥業有限公司，批號2103E3，10 mg/瓶。

1.3 主要試劑及儀器

PTEN、Akt、CyclinD1、CDK4、GAPDH 抗體、HRP標記山羊抗小鼠IgG、HRP標記山羊抗兔IgG，美國Proteintech，貨號分別為22034-1-AP、10176-2-AP、26939-1-AP、11026-1-AP、10494-1-AP、SA00001-1、SA00001-2；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體，美國Boster，貨號BM0000；Ⅰ型膠原（ColⅠ）ELISA試劑盒，武漢華美生物工程有限公司，貨號CSBE08084r；基質金屬蛋白酶9（MMP9）ELISA試劑盒，美國Proteintech，貨號KE20006；mRNA反轉錄試劑盒，北京康為世紀，貨號CW2569；miRNA反轉錄試劑盒，北京康為世紀，貨號CW2141。熒光定量PCR儀（美國Thermo，型號PIKOREAL96），-80 ℃冰箱（中國美菱，型號DW-HW438），臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號H1650R），臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號H1650R），小動物專用彩色多普勒超聲儀（飛依諾科技有限公司，型號6LAB），全自動酶標洗板機（深圳市匯松科技發展有限公司，型號PW-812），多功能酶標分析儀（深圳匯松科技發展有限公司，型號MB-530），顯微攝像圖像分析系統（廈門Motic，型號BA410T）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

大鼠適應性飼養1周后，隨機取6只作為正常組，余40只行阿霉素腹腔注射造模[8]。將10 mg阿霉素粉針劑溶于生理鹽水5 mL，配成濃度為2 mg/mL溶液，按1.5 mg/kg腹腔注射，每周2次，連續7周。正常組注射生理鹽水1 mL/kg。末次注射后正常飼養1周，行心臟超聲檢測，并隨機取4只造模大鼠左心室心肌和肺組織行HE、Masson染色。以大鼠出現精神萎靡、體質量增長緩慢、毛發枯黃、腹水等表現，超聲心動圖示左室短軸縮短率（LVFS）＜30%[9]，HE染色見心肌細胞溶解，Masson染色見大量藍色膠原纖維[10]，即為造模成功。造模中共8只大鼠死亡，剩余32只成模大鼠按隨機數字表法分為模型組12只、心康沖劑組和纈沙坦組各10只。

2.2 給藥

參考前期給藥劑量[11]，心康沖劑組予心康沖劑0.5 g/kg灌胃，纈沙坦組予纈沙坦30 mg/kg灌胃，正常組、模型組予等體積蒸餾水灌胃，每日1 次，連續4周。

2.3 指標檢測

2.3.1 心臟超聲檢測

大鼠予2.5%異氟烷吸入麻醉，取胸前仰臥位固定，脫毛后涂耦合劑，用小動物專用彩色多普勒超聲儀，取大鼠左心室長軸切面行M型超聲檢測，連續記錄10 個心動周期，測量LVFS 和左室射血分數（LVEF）。

2.3.2 ELISA檢測

大鼠經腹主動脈采血10 mL，3 500 r/min 離心10 min，取血清，按照試劑盒說明書操作，酶標儀測量各孔光密度（OD值），根據標準曲線計算血清ColⅠ和MMP9含量。

2.3.3 HE染色

剪取大鼠左心室心尖投入液氮凍存。余下左心室投入10%多聚甲醛溶液固定，制作石蠟切片，脫水、蘇木精染液染色后自來水沖洗，再經75%鹽酸酒精分化、氨水處理、酸化伊紅乙醇液染色，梯度脫水，透明，封片，于顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

2.3.4 Masson染色

取左心室組織石蠟切片，脫水，先后用10%重鉻酸鉀-10%三氯乙酸（1∶1）混合液、0.5%天晴石蘭、蘇木素溶液染色，自來水沖洗，再以0.5%鹽酸酒精分化液分化，復紅、脫水、透明、封固，采集5個包含2 mm2心肌面積區域圖像，應用IBASⅡ圖像分析系統計算膠原容積分數（CVF）。CVF（%）=心肌膠原面積÷所測視野總面積×100%。

2.3.5 免疫熒光染色

左心室組織石蠟切片脫蠟、水化后，浸入EDTA緩沖液（pH=9.0）連續煮24 min后冷卻，PBS洗滌，3 min×3次，經漂洗、脫水、蘇丹黑染色后封閉1 h，加入α-SMA一抗（1∶100），4 ℃避光孵育過夜，再滴加熒光二抗，DAPI避光染色，甘油封片，避光保存，采用熒光顯微鏡觀察，Image J軟件進行定量分析。

2.3.6 qRT-PCR檢測

稱取500 mg左心室組織樣品，剪碎后加入Trizol裂解，根據反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，RT-PCR進行擴增。反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40個循環。2-ΔΔCt法計算目的基因表達量，引物由上海生工合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.3.7 Western blot檢測

采用RIPA 裂解液提取大鼠左心室組織總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。分別取30 μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE將蛋白分離，轉膜、封閉后，加入一抗：Akt（1∶1 000）、CDK4（1∶1 000）、CyclinD1（1∶500）、PTEN（1∶2 000）、GAPDH（1∶3 000），4 ℃孵育過夜，洗去一抗，加二抗（HRP標記山羊抗小鼠IgG 1∶5 000、HRP 標記山羊抗兔IgG 1∶6 000），孵育，顯色、曝光、掃描，以GADPH為內參，分析蛋白相對表達量。

3 統計學方法

采用SPSS20.0 統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，先進行正態性和方差齊性檢驗，滿足正態性采用方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD檢驗，方差不齊用Games Howell檢驗；不滿足正態性采用秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

正常組大鼠毛色光澤，眼睛有神，反應靈敏，體質量明顯增加，飲食及二便正常，無腹水及死亡；模型組大鼠毛發無光澤并脫落，活動遲鈍，精神萎靡，喜蜷縮，形體瘦小但嚴重腹水，生長基本停滯，大便稀，共死亡6只；心康沖劑組和纈沙坦組大鼠毛發較有光澤，動作較靈敏，體質量有一定增加，有輕度腹水，各死亡4只。

4.1 心康沖劑對模型大鼠心功能的影響

與正常組比較，模型組大鼠LVFS、LVEF顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，心康沖劑組和纈沙坦組大鼠LVFS、LVEF顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠LVFS、LVEF比較（±s，%）

表2 各組大鼠LVFS、LVEF比較（±s，%）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

LVEF 97.91±1.53 59.29±4.50*74.35±2.19△74.29±1.97△組別正常組模型組心康沖劑組纈沙坦組只數6 6 6 6 LVFS 75.05±5.54 27.59±2.86*38.30±1.83△38.15±1.64△

4.2 心康沖劑對模型大鼠血清Ⅰ型膠原和基質金屬蛋白酶9含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清ColⅠ和MMP9含量顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，心康沖劑組和纈沙坦組大鼠血清ColⅠ和MMP9 含量顯著減少（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清ColⅠ和MMP9含量比較（±s，pg/mL）

表3 各組大鼠血清ColⅠ和MMP9含量比較（±s，pg/mL）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

MMP9 980.074± 160.395 11 568.363±1 227.633*2 739.909±1 219.731△2 680.185± 716.984△組別正常組模型組心康沖劑組纈沙坦組只數6 6 6 6 ColⅠ802.778± 51.697 6 482.041±325.942*1 020.056±124.152△1 108.723±183.993△

4.3 心康沖劑對模型大鼠左心室病理形態的影響

HE染色顯示，正常組大鼠心肌細胞呈紅色，細胞核呈藍色，心肌細胞壁完整，細胞排列整齊；模型組大鼠心肌細胞腫脹變性、胞漿溶解，細胞壁模糊，細胞排列紊亂；心康沖劑組和纈沙坦組大鼠心肌細胞腫脹、胞漿溶解程度相對較輕，部分細胞壁較完整。見圖1。

圖1 各組大鼠左心室組織形態（HE染色，×400）

Masson染色顯示，正常組大鼠肌纖維呈紅色，有極少量藍色膠原纖維；與正常組比較，模型組大鼠可見大量藍色膠原纖維，夾有紅色肌纖維，CVF顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，心康沖劑組和纈沙坦組大鼠藍色膠原纖維相對較少，CVF 顯著減少（P＜0.05）。見圖2、表4。

表4 各組大鼠左心室CVF比較（±s，%）

表4 各組大鼠左心室CVF比較（±s，%）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

CVF 4.270±1.074 26.310±4.586*13.603±1.394△14.737±3.756△組別正常組模型組心康沖劑組纈沙坦組只數6 6 6 6

4.4 心康沖劑對模型大鼠左心室α-平滑肌肌動蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠左心室α-SMA表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，心康沖劑和纈沙坦組大鼠左心室α-SMA 表達顯著降低（P＜0.05）。見圖3、表5。

圖3 各組大鼠左心室α-SMA陽性表達（免疫熒光染色，×400）

表5 各組大鼠左心室α-SMA表達比較（±s）

表5 各組大鼠左心室α-SMA表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

α-SMA 3 2 123.000±441.290 3 5 746.000±563.067*3 2 712.667± 88.342△3 2 726.667± 72.459△組別正常組模型組心康沖劑組纈沙坦組只數

4.5 心康沖劑對模型大鼠左心室生長阻滯特異性轉錄本5、miR-21、磷酸酶及張力蛋白同源物基因表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠左心室GAS5、PTEN基因表達顯著降低，miR-21表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，心康沖劑組和纈沙坦組大鼠左心室GAS5、PTEN基因表達顯著升高，miR-21表達顯著降低（P＜0.05）；與纈沙坦組比較，心康沖劑組GAS5基因表達降低，miR-21表達升高（P＜0.05）。見表6。

表6 各組大鼠左心室GAS5、miR-21、PTEN基因表達比較（±s）

表6 各組大鼠左心室GAS5、miR-21、PTEN基因表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與纈沙坦組比較，▲P＜0.05

組別正常組模型組心康沖3 3劑組3組3纈沙坦PTEN 1.034±0.102 0.125±0.031*0.382±0.142△0.541±0.091△只數GAS5 1.036±0.105 0.184±0.029*0.367±0.083△▲0.593±0.081△miR-21 1.037±0.117 8.747±1.377*4.606±0.990△▲2.991±0.634△

4.6 心康沖劑對模型大鼠左心室Akt、周期蛋白依賴性激酶4、磷酸酶及張力蛋白同源物、周期蛋白D1 蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠左心室Akt、CDK4、CyclinD1蛋白表達顯著升高，PTEN蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，心康沖劑組和纈沙坦組大鼠左心室Akt、CDK4、CyclinD1蛋白表達顯著降低，PTEN蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。見圖4、表7。

圖4 各組大鼠左心室Akt、CDK4、PTEN、CyclinD1蛋白免疫印跡

表7 各組大鼠左心室Akt、CDK4、PTEN、CyclinD1蛋白表達比較（±s）

表7 各組大鼠左心室Akt、CDK4、PTEN、CyclinD1蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別CyclinD1只數Akt CDK4 PTEN正常組模型組心康沖劑組纈沙坦組0.355±0.046 0.715±0.033*0.538±0.045△0.487±0.043△3 3 3 3 0.100±.0790 0.667±0.103*0.453±0.082△0.312±0.044△0.100±0.039 0.551±0.053*0.396±0.090△0.286±0.051△0.553±0.082 0.186±0.055*0.362±0.028△0.400±0.150△

5 討論

心肌纖維化可導致心功能異常，抗心肌纖維化是治療CHF的一個方向[12]。CFs活化增殖是心肌纖維化發生發展的中心環節。CyclinD1通過激活G1期特有的CDK4蛋白推動細胞周期由G1期進入S期，促進細胞分裂、增殖。當CyclinD1、CDK4過表達后，可促進成纖維細胞增殖，從而促使心肌纖維化發生[13]。PTEN可抑制Akt激活后上調的ColⅠ、Ⅲ型膠原蛋白、α-SMA及MMP2合成，抑制CyclinD1和CDK4誘導的細胞增殖[13-14]，阻止細胞G1/S期轉化，抑制纖維化形成[15]。相反，如PTEN表達被抑制，則上調CyclinD1、CDK4表達，促進細胞G1/S期轉化，促使纖維化形成。長鏈非編碼RNA GAS5可以堿基互補配對為基礎共享結合miR-21 反應元件，通過“海綿樣”吸附miR-21，使miR-21 功能降低或喪失，削弱miR-21 對PTEN 的抑制，使PTEN在轉錄水平表達升高[16]，從而抑制Akt活化后誘導的細胞增殖。

根據臨床癥狀，可將心肌纖維化歸屬于中醫學“心悸”“喘證”“水腫”等范疇。毛以林教授經過長期臨床實踐認為，心力衰竭心肌纖維化的關鍵病機是宗氣下陷、脾腎陽虛、水濕內停[17]。心康沖劑以真武湯、升陷湯及參苓白術散為基礎組成，能升補宗氣、溫陽利水，對CHF水濕浸漬患者能利尿消腫，提高心功能，改善預后。方中大劑黃芪、人參補心肺以升宗氣，共為君藥；茯苓、薏苡仁健脾利水，陳皮行氣利水，砂仁運脾化濕，共為臣藥；制附片溫腎陽，桂枝溫陽化氣，生姜皮、大腹皮專利肌膚之水，共為佐藥；柴胡、升麻提升清陽之氣，桔梗舟楫之藥，為使，諸藥和而為功。前期研究表明，心康沖劑可抑制miR-21、Akt表達，促進PTEN表達，逆轉心肌纖維化[6-7，18]。本實驗顯示，模型組大鼠HE 染色可見心肌細胞溶解，LVFS、LVEF降低，說明其心功能下降。免疫熒光染色、Masson染色顯示模型組大鼠心肌纖維化明顯，且miR-21、Akt、CDK4、CyclinD1、MMP9、ColⅠ表達升高，GAS5、PTEN 表達降低，提示模型組大鼠GAS5、PTEN表達受抑制，CFs增殖活躍。經心康沖劑干預后，模型大鼠LVEF、LVFS升高，心肌細胞腫脹較輕，MMP9、ColⅠ含量降低，說明心康沖劑可提高大鼠心功能，減輕心肌纖維組織增生，可能通過上調GAS5、PTEN 表達，下調miR-21、Akt、CDK4、CyclinD1表達阻滯CFs增殖。本研究探討了心康沖劑對GAS5/miR-21 介導的CHF 大鼠CFs 增殖的調控作用，為心康沖劑抗心肌纖維化提供更多依據。然而本結果并未完全說明心康沖劑可通過GAS5/miR-21靶向調控PTEN/Akt通路抑制CDK4、CyclinD1表達，從而實現細胞增殖阻滯。今后將分別對GAS5、miR-21進行靶向調控，再觀察心康沖劑對PTEN/Akt通路及CFs增殖的影響，以進一步明確其是否通過GAS5/miR-21靶向調控PTEN/Akt通路抑制細胞增殖。