基于芳香烴受體探討青黛及其主要成分緩解潰瘍性結腸炎的作用機制

高陽 ，顧思臻 ，薛艷 ，劉曉雯 ，竇丹波

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203； 2.同濟大學附屬養志康復醫院，上海 201619

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種局限于黏膜及黏膜下層的非特異性腸道炎癥性疾病，具有慢性、難治性、復發性的特點，臨床表現為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重及不同程度的全身癥狀[1]。UC全球發病率有逐年升高趨勢[2]。目前其發病機制尚未明確，主要與遺傳、環境、感染、免疫等因素有關。現代醫學治療UC存在療效不穩定、不良反應較多等問題[3]。

研究顯示，口服青黛治療活動期UC臨床療效顯著[4]，基礎研究表明，青黛發揮作用可能與激活AHR/CYP1A1通路有關[5]。課題組前期通過網絡藥理學分析篩選出青黛治療UC的9個主要成分，包括靛藍、靛玉紅和色胺酮等，并通過分子對接發現靛藍、靛玉紅和色胺酮均為芳香烴受體（AHR）的配體[6]。因此，本研究以AHR及其下游關鍵分子為切入點，采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導C57BL/6小鼠UC模型，明確青黛及其主要成分靛藍、靛玉紅和色胺酮對UC的影響及作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠42只，體質量18～25 g，上海吉輝實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（滬）2022-0009。飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，溫度22～25 ℃，濕度50%，自由攝食飲水。每日清潔飼養籠，隔日更換墊料，適應性飼養7 d。本實驗經上海中醫藥大學動物實驗倫理委員會審批（PZSHUTCM200821015）。

1.2 藥物及制備

建青黛[7]，為爵床科植物馬藍Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.的葉或莖葉經加工制成的干燥粉末，購于福建省德龍藥業，批號FJ20180005，中國GMP藥品證書FJ20180005；靛藍，北京索萊寶公司，貨號SI8050，純度≥98%；靛玉紅，北京索萊寶公司，貨號SI8060，純度≥98%；色胺酮，上海源葉公司，貨號S31557，純度≥98%。以上藥物分別用0.5%羧甲基纖維素鈉溶解，制成建青黛、靛藍、靛玉紅、色胺酮濃度分別為0.06、0.03、0.001、0.03 g/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

羧甲基纖維素鈉，北京索萊寶公司，貨號c8621；多聚甲醛固定液，北京索萊寶公司，貨號p1110；細胞色素P4501A1（CYP1A1）抗體，美國Proteintech，貨號13241-1-AP；AHR 抗體，美國CST 公司，貨號83200S；白細胞介素（IL）-10抗體，美國Proteintech公 司， 貨 號20850-1-AP； IL-22 抗 體， 美 國Proteintech，貨號13462-1-AP；TB Green qPCR 試劑盒，日本TAKARA，貨號RR420A。

蛋白電泳儀（上海天能，型號VE-180），蛋白轉膜儀（上海天能，型號VE-186），5417R臺式冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司，型號5417R），電熱恒溫水浴鍋（上海精宏，型號DK-S26），分光光度計（美國Thermo，型號NanoDrop 2000），PCR儀（德國Analytik Jena公司，型號SL96），qPCR儀（美國ABI公司，型號Stepone plus），凝膠成像系統（上海天能，型號GIS2009）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

按隨機區組法將42只小鼠隨機分為空白組、模型組、青黛組、靛藍組、靛玉紅組和色胺酮組，每組7只。空白組正常飲水，其余各組飲用4%DSS溶液（將DSS用純水溶解，現配現用）制備急性UC模型，連續10 d。

2.2 給藥

造模第4日開始，青黛組予青黛溶液600 mg/kg灌胃，靛藍組予靛藍溶液300 mg/kg灌胃[8]，靛玉紅組予靛玉紅溶液10 mg/kg灌胃[9]，色胺酮組予色胺酮溶液300 mg/kg灌胃[10-11]，均相當于臨床成人等效劑量。空白組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，連續7 d。

2.3 取材

末次給藥后小鼠禁食24 h，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，75%乙醇消毒腹部，沿腹部中線剪開，充分暴露腹膜和腹腔，用鑷子分離結腸和回腸，將結腸置于冰上，PBS沖洗結腸組織，剝離多余脂肪，用標尺測量結腸長度。縱剖結腸，取出結腸內容物，PBS沖洗，濾紙吸去多余水分，用剪刀剪取病變最明顯處結腸組織，置于4%多聚甲醛中固定。其余結腸組織放于EP管內，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4 一般狀況觀察

造模及給藥期間，每日記錄各組小鼠體質量、精神活動狀態、毛發色澤、進食量和飲水量、大便性狀及存活情況。

2.5 結腸組織病理觀察

結腸組織置于多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，制成5 μm切片，常規HE染色，光學顯微鏡下觀察結腸組織形態變化。

2.6 Western blot檢測

取結腸組織，加入適量RIPA 裂解液（含1%PMSF）提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%電泳分離90 min，濕轉法轉膜（300 mA、60 min），用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，滴加CYP1A1 一抗（1∶1 000）、AHR一抗（1∶1 000）、IL-10一抗（1∶1 000）、IL-22一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。PBST洗膜4次，每次8 min，加二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。PBST洗膜4次，超敏ECL液顯影。以GAPDH為內參，采用Image J軟件分析目的蛋白相對灰度值。

2.7 RT-PCR檢測

參照總RNA提取試劑盒提取結腸組織總RNA，測定RNA濃度后將其反轉錄成cDNA，進行實時熒光定量PCR 檢測。反應條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，共40個循環。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統計學方法

采用SPSS22.0 統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，符合正態分布且方差齊組間比較用方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 青黛及其主要成分對模型小鼠一般狀況的影響

空白組小鼠毛色光澤，活動靈敏，飲食量、飲水量及糞便情況正常。模型組小鼠毛發粗糙，活動量減少，體質量下降，飲食量減少，出現肉眼可見的肛周血便、稀便；青黛組、靛藍組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠毛色、體質量、精神狀態和血便等情況較模型組有不同程度改善。與空白組比較，模型組小鼠體質量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，青黛組、靛藍組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠體質量明顯升高（P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠體質量比較（±s，g）

表2 各組小鼠體質量比較（±s，g）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

體質量22.37±0.67 15.16±0.63**19.99±0.23##20.09±1.15##20.04±0.63##20.06±0.62##組別空白組模型組青黛組靛玉紅組靛藍組色胺酮組只數7 7 7 7 7 7

4.2 青黛及其主要成分對模型小鼠結腸長度及結腸形態的影響

與空白組比較，模型組小鼠結腸長度明顯縮短（P＜0.01）；與模型組比較，青黛組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠結腸長度明顯增加（P＜0.01，P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠結腸長度比較（±s，cm）

表3 各組小鼠結腸長度比較（±s，cm）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

結腸長度6.91±0.24 4.76±0.59**5.70±0.54##6.11±0.32##5.11±0.40 5.30±0.44#組別空白組模型組青黛組靛玉紅組靛藍組色胺酮組只數7 7 7 7 7 7

HE染色顯示，空白組小鼠結腸黏膜、腺體完整，隱窩正常，無水腫及炎性細胞浸潤；模型組小鼠結腸黏膜缺損，腺體不完整，隱窩縮短或消失，杯狀細胞減少，出現炎性細胞浸潤及黏膜下層水腫等變化；青黛組、靛藍組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠結腸組織潰瘍及黏膜損傷程度明顯減輕，水腫和炎性細胞浸潤有不同程度改善。見圖1。

圖1 各組小鼠結腸組織形態（HE染色，×200）

4.3 青黛及其主要成分對模型小鼠結腸組織芳香烴受體、細胞色素P4501A1、白細胞介素-10、白細胞介素-22蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠結腸組織CYP1A1、IL-10、IL-22蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠結腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖2、圖3。

圖2 各組小鼠結腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22蛋白免疫印跡

圖3 各組小鼠結腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22蛋白表達比較（±s，每組7只）

4.4 青黛及其主要成分對模型小鼠結腸組織芳香烴受體、細胞色素P501A1、白細胞介素-10、白細胞介素-22 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠結腸組織AHR、IL-10、IL-22 mRNA 表 達 明 顯 降 低（P＜0.01），CYP1A1 mRNA表達有降低趨勢（P＞0.05）；與模型組比較，靛玉紅組和色胺酮組小鼠結腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 mRNA表達明顯升高（P＜0.01），靛藍組小鼠結腸組織AHR、CYP1A1、IL-22 mRNA表達明顯升高（P＜0.01），青黛組小鼠結腸組織AHR、IL-10 mRNA表達明顯升高（P＜0.01）。見表4。

表4 各組小鼠結腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 mRNA表達比較（±s）

表4 各組小鼠結腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白組模型組青黛組靛藍組靛玉紅組色胺酮組IL-22 73.12±19.76 3.56± 2.27**19.97± 6.94 34.56± 3.18##143.46± 8.62##207.05±13.02##只數7 7 7 7 7 7 AHR 3.31±0.25 0.46±0.06**2.14±0.64##1.78±0.18##3.42±1.01##5.59±0.53##CYP1A1 69.18±15.36 22.89± 3.30 36.20± 4.78 166.96±85.04##117.42±17.09##259.51± 6.17##IL-10 53.59± 2.81 11.87± 1.58**69.53± 7.42##19.65± 0.71 85.28± 6.94##126.50±25.48##

5 討論

青黛有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚等功效。口服青黛方藥多用于治療血證，包括血熱吐衄、胸痛咳血、溫毒發斑等，如《端效方》青金散治吐血不止，“青黛二錢，新水調下”；《本經逢原》謂其能“散郁火，治溫毒發斑及產后熱痢下重”；《本草求真》言：“青黛，大瀉肝經實火及散肝經火郁……痢血等癥。”UC發作以便膿血為主，鏡下表現為腸黏膜潰瘍、糜爛、出血等，屬中醫學“久痢”“血證”等范疇。臨床研究顯示，口服青黛對UC患者有良好的治療效果[12]，對于中度UC活動期患者病情緩解效果顯著[4]，不同劑量青黛聯合西藥治療后，其臨床有效率、緩解率和黏膜愈合率均顯著高于安慰劑組[13]。實驗研究表明，青黛能下調UC模型小鼠脾臟CD4+T細胞表達[14]，抑制小鼠炎癥反應并促進黏膜修復[15]，升高短鏈脂肪酸受體GPR41、GPR43表達，調節Treg/Th17平衡，發揮治療UC作用[16]；體外實驗顯示，青黛能通過降低炎癥因子IL-6表達發揮抗炎效果[17]。以上結果均提示青黛具有治療UC潛能，但相關機制仍需進一步探索。

AHR是由805個氨基酸組成的胞質轉錄因子[18]，非活性狀態的AHR可被其配體激活，活化的AHR從復合態轉變為游離態，進一步與細胞核內AHR核轉位蛋白結合為二聚體，從而促進下游基因轉錄[19]。AHR可以調節細胞分化和細胞凋亡，發揮抗炎作用[20]。研究顯示，UC患者AHR mRNA表達明顯低于對照組[21]。動物實驗顯示，使用AHR拮抗劑后，UC小鼠結腸炎癥程度進一步加重；AHR基因敲除UC小鼠出現不同程度的結腸組織損害、隱窩結構變形、上皮細胞壞死水腫及中性粒細胞和淋巴細胞浸潤[22]，提示上調AHR表達能緩解結腸炎癥狀態。AHR與配體結合后能上調CYP1A1 表達，CYP1A1 表達升高是AHR 活化的標志[5]，激活AHR/CYP1A1信號通路可能是抑制UC炎癥的作用機制。IL-10作為一種抗炎因子，其表達水平與UC疾病進展有關。AHR/CYP1A1信號通路活化后能促進IL-10表達和分泌，進而誘導腸上皮細胞IL-10受體（IL-10R1）表達[23]。IL-10 與IL-10R1 結合后，介導信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）磷酸化，p-STAT3通過上調抗凋亡和增殖相關基因轉錄促進腸黏膜愈合。臨床研究發現，中重度UC 患者結腸黏膜IL-10表達明顯低于輕度UC患者及正常組[24]，而IL-10基因敲除小鼠可出現自發性腸炎[25]。IL-22在UC發病中起重要作用，可通過誘導產生多種抗菌肽保護腸道上皮細胞屏障功能。IL-22由多種細胞產生，包括自然殺傷細胞、活化T細胞、輔助性T細胞17等。腸道中IL-22主要由維甲酸相關孤兒受體γt 相關的固有淋巴細胞ILC3產生[26]。此外，腸道微生物能通過激活AHR影響IL-22表達。

本研究通過DSS自由飲用建立UC小鼠模型，并分別予青黛、靛藍、靛玉紅及色胺酮進行干預，結果表明，模型小鼠結腸長度縮短和體質量下降有所恢復，同時結腸組織病理變化明顯減輕，黏膜損傷、水腫、潰瘍情況好轉，炎性細胞浸潤減少。進一步采用Western blot檢測AHR/CYP1A1信號通路相關蛋白表達，青黛組、靛藍組、靛玉紅組和色胺酮組小鼠結腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 蛋白表達顯著上調。PCR結果顯示，靛玉紅組和色胺酮組小鼠結腸組織AHR、CYP1A1、IL-10、IL-22 mRNA表達顯著升高。提示青黛及其主要成分靛藍、靛玉紅、色胺酮可能通過激活AHR/CYP1A1通路上調抗炎因子IL-10和IL-22表達，進而改善UC。其中以靛玉紅和色胺酮改善各項指標作用最明顯。本研究對青黛及其主要成分治療UC的作用機制進行探討，可為中醫藥治療UC提供實驗依據。