高抗氧化活性黑皮雞樅優良菌株篩選

李春蘭，李佳歡，胡開輝，梁 鵬*

（1.福建農林大學食品科學學院，福建福州 350002；2.福建農林大學生命科學學院，福建福州 350002）

黑皮雞樅（Hymenopellis raphanipes）是長根菇的商品名，又名長壽菇、露水雞樅、卵孢小奧德蘑、二孢擬奧德蘑，俗稱黑皮雞樅菌，是近年來食用菌工廠化栽培的熱門菌種之一。其在分類學上屬擔子門傘菌綱傘菌目膨瑚菌小奧德蘑屬[1]。由于黑皮雞樅菌香味馥郁，肉質鮮嫩，含有豐富的氨基酸、維生素、多糖及礦物質元素等多種營養成分，并有抗氧化[2]、保護肝臟[3-4]、調整腸道菌群[5]、抑制病原菌[6]等生物活性，具有極高的食藥用價值，受到眾多消費者的喜愛。盧彩會等人測定黑皮雞樅水提物和醇提物的抗氧化活性，證實了2 種提取物對DPPH 自由基、羥自由基和ABTS 自由基均有較好的清除能力，對鐵離子的還原能力隨著添加量的增加而逐漸提高，且水提物比醇提物的抗氧化能力更強[2]；安曉雯等則通過比較分析黑皮雞樅、平菇、海鮮菇、白玉菇、香菇和金針菇等6種食用菌的營養成分、抗氧化活性等，得出黑皮雞樅的抗氧化能力最高[7]。因此，選育高抗氧化活力的菌株對于黑皮雞樅產業的高質量發展具有重要意義。目前，國內外研究人員對黑皮雞樅的研究重點在其營養成分和培養條件優化等方面，鮮見關于對不同黑皮雞樅菌株抗氧化活性的報道。本試驗通過比較8 個黑皮雞樅菌株篩選出高抗氧化活性的優良菌株，以期對黑皮雞樅的深加工提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

供試8 個黑皮雞樅菌株編號分別為HP1、HP2、HP3、HP4、HP5、HP6、HP7、HP8，全部由福建農林大學生命科學學院生物工程專業實驗室饋贈。

1.1.2 培養基

斜面培養基（PDA）：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L，pH 自然。115 ℃滅菌30 min，緩慢冷卻。

加富培養基：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母粉2 g、KH2PO42.5 g、MgSO4·7H2O 1 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。115 ℃滅菌30 min。

液體培養基：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母粉2 g、KH2PO42.5 g、MgSO4·7H2O 1 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑和儀器

試劑：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、ABTS、DPPH、無水乙醇、水楊酸、FeSO4·7H2O、無水碳酸鈉、過氧化氫等。

儀器：超凈工作臺、水浴鍋、酶標儀、紫外分光光度計、電磁爐、制冰機、離心機、分析天平、高壓滅菌器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化

將4 ℃保藏的黑皮雞樅菌株接種于PDA 固體斜面培養基進行活化，置于25 ℃生化培養箱內培養10 d左右；選取已活化好的試管菌株進行擴大培養，用接種鉤挑取0.5 cm×0.5 cm 接種塊接種于加富培養基平皿中心，于25 ℃恒溫培養，48 h后倒置培養。

1.2.2 液體菌種的制備

將200 mL 液體培養基裝入500 mL 搖瓶中，115 ℃滅菌30 min，冷卻備用。將已經活化好的平皿刮去氣生菌絲，再使用8 mm 打孔器在距舊接種塊相同距離處進行打孔，取25個接種塊于液體培養基中，25 ℃培養24 h，再放入25 ℃、150 r·min-1搖床中培養。第3天開始用磁力攪拌器攪拌20 min·d-1，培養5 d。

1.2.3 搖瓶發酵

250 mL 搖瓶裝100 mL 液體培養基，115 ℃滅菌30 min，冷卻備用。液體菌種接種，接種量為5%，25 ℃、150 r·min-1搖床發酵6 d。培養完成后將發酵液進行過濾，測定菌球濕重、干重，再將發酵液9 000 r·min-1離心15 min，測定還原糖、總酚等活性物質含量及發酵液的抗氧化活性。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 菌絲生長性狀

觀察各菌株菌絲在加富培養基上的生長狀態，采用“十”字交叉法測定菌落半徑（R），用游標卡尺測量生長長度，單位為mm；液體發酵，觀察菌球生長情況，發酵結束測定生物量。菌絲生長速度按以下公式計算。

1.3.2 還原糖含量測定

發酵液中還原糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸法[8]，稍作修改。以葡萄糖為標準品。取適當稀釋的發酵液0.5 mL，再加入0.75 mL DNS 試劑，混勻，沸水浴7 min 后立即放入冰水混合物中冷卻，然后定容至5 mL，于540 nm處測定吸光度（A）。

1.3.3 可溶性蛋白含量測定

發酵液中可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍染色法[9]，稍作修改。以牛血清白蛋白為標準品。取適當稀釋的發酵液1 mL，加入5 mL Bradford 工作液，顯色10 min后在595 nm下測定吸光度（A）。

1.3.4 總酚含量測定

發酵液中總酚含量測定采用Folin-Ciocalten 法[10]，稍作修改。以沒食子酸（Gallic acid）為標準品。25μL適當稀釋的發酵液加入96 孔板中，然后加入125 μL福林酚試劑，室溫下反應10 min 后加入125 μL 飽和Na2CO3溶液，振蕩器上搖1 min，搖勻后室溫下放置反應30 min，然后在765 nm下測定吸光度。

1.3.5 總黃酮含量測定

采用氯化鋁絡合分光光度法測定發酵液總黃酮含量[11]，稍作修改。以蘆丁為標準品。取適當稀釋的發酵液50 μL 于96 孔板中，依次加入100 μL 的AlCl3和50μL醋酸-醋酸鈉緩沖液，搖勻40 ℃反應15 min，于400 nm處測定吸光度。

1.3.6 ABTS自由基清除活性測定

參照Re R 等[12]測定ABTS 抗氧化能力方法并稍作修改。以VC作陽性對照。取250μL發酵液于10 mL容量瓶中，蒸餾水定容。在96 孔板中加入75μL 稀釋的發酵液，再加入125 μL 的ABTS 工作液，緩慢搖勻，避光放置15 min，在734 nm下測定吸光度（As），同時取75μL 蒸餾水代替稀釋液測得空白吸光度（Ac），以無水乙醇代替ABTS 工作液測得稀釋液本底吸光度（Aj）。每個樣品做4個平行，取其平均值。

清除率計算公式為：

1.3.7 DPPH自由基清除活性測定

參照趙琳琳等[13]測定DPPH 清除自由基能力方法并稍作修改。以VC作陽性對照。取2.5 mL 發酵液于10 mL 容量瓶中，蒸餾水定容。在96 孔板中加入100μL 稀釋液，再加入100μL 的DPPH 溶液，室溫避光震蕩30 min，在517 nm 下測定吸光度（As），取100μL 水代替稀釋液測得空白吸光度（Ac），以無水乙醇代替DPPH 溶液測得稀釋液本底吸光度（Aj）。每個樣品做4個平行，取其平均值。按公式（2）計算清除率。

1.3.8 羥自由基清除活性測定

參照Liu Y 等[14]測定羥自由基清除能力時采用的水楊酸法并稍作修改。以VC做陽性對照。取250 μL發酵液于10 mL 容量瓶中，蒸餾水定容。在96 孔板中加入50μL 稀釋液，依次加入50μL 的FeSO4（現配現用）、50 μL 的水楊酸-乙醇溶液、50 μL 的H2O2，37 ℃反應30 min，然后于510 nm 處測定吸光度（As）；取50 μL 水代替稀釋液測得空白吸光度（Ac），不加H2O2溶液為稀釋液本底吸光度（Aj）。每個樣品做4 個平行，取其平均值。按公式（2）計算清除率。

1.3.9 還原能力測定

參照Liu Q 等[15]測定還原能力方法并稍作修改。吸光值越大，還原力越強。取100μL適當稀釋的發酵液于2 mL 離心管，依次加入250 μL 磷酸鈉緩沖液和250 μL 的K3Fe(CN)6，50 ℃水浴20 min，加入100 μL的TFA 終止反應，4 000 r·min-1離心10 min。取上清100μL和去離子水混合，加入20μL的FeCl3室溫孵育15 min，于700 nm 下測定吸光度（A）。水代替發酵液作空白對照，以0.25 mg·mL-1的VC作為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 不同菌株的菌絲形態特征比較

2.1.1 菌絲生長情況

由表1 可知，不同黑皮雞樅菌株在加富培養基上的菌絲長勢存在差異，其中HP1、HP6、HP7、HP8的菌絲長勢較強，菌絲粗壯濃密；HP2、HP3、HP4、HP5 長勢弱，菌絲纖細稀疏。同時不同黑皮雞樅菌的菌絲生長速度間差異明顯，其中以HP5 生長速度最快，達5.09 mm·d-1，與HP3、HP4 無顯著性差異，但是顯著快于其他菌株；其次是HP6、HP1，生長速度為4.80、4.60 mm·d-1；生長速度最慢的是HP8，為4.36 mm·d-1。

表1 不同黑皮雞樅菌株的菌絲生長情況

2.1.2 菌株液體發酵生物量

由表2 可知，不同黑皮雞樅菌株搖瓶發酵培養生物量存在差異，其中以HP6 的菌球干重最大，達1.308 8 g·(100 mL)-1，顯著高于其他菌株；其次是HP8、HP1，分別為0.848 0、0.827 1 g·(100 mL)-1，顯著高于剩余菌株；HP2 的生物量最低，菌球干重僅0.182 8 g·(100 mL)-1。

表2 不同黑皮雞樅菌株發酵生物量

2.2 不同菌株的營養成分比較

2.2.1 還原糖含量

由表3 可看出，黑皮雞樅菌株HP2、HP5 發酵液中還原糖含量最高，為56.71、54.62 mg·mL-1，顯著高于其他6 個菌株；其次是HP1，為50.29 mg·mL-1；其余菌株的還原糖含量均低于50.00 mg·mL-1。

表3 不同黑皮雞樅菌株發酵液的還原糖、可溶性蛋白含量

2.2.2 可溶性蛋白含量

由表3 可看出，黑皮雞樅菌株HP6 發酵液中可溶性蛋白含量最高，達47.44 μg·mL-1，顯著高于其他7個菌株；其次是HP3、HP8、HP1，分別為42.29、39.06、38.47μg·mL-1；其余菌株的可溶性蛋白含量均低于35.00μg·mL-1。

2.3 不同菌株的抗氧化活性比較

2.3.1 抗氧化活性物質含量

2.3.1.1 總酚含量

總酚具有清除自由基、抗氧化的作用，其含量越高，抗氧化能力越強。由表4 看出，黑皮雞樅菌株HP1 發酵液中總酚含量最高，達240.12 μg·mL-1，顯著高于其他7 個菌株；其余依次為HP2、HP6、HP7、HP3、HP5、HP8、HP4，分別是229.80、223.85、223.85、212.55、207.19、207.09、198.52μg·mL-1。

表4 不同黑皮雞樅菌株發酵液的總酚、總黃酮含量

2.3.1.2 總黃酮含量

黃酮是一種強抗氧化劑，可有效清除多種自由基，黃酮含量高說明其抗氧化能力強。由表4 可知，比較8個黑皮雞樅菌株的總黃酮含量發現，HP6的含量最高，達24.72μg·mL-1；其次是HP1，總黃酮含量為23.23μg·mL-1；最低的是HP4，含量僅為18.79μg·mL-1。

2.3.2 抗氧化活性分析

2.3.2.1 ABTS自由基清除能力

由表5可知，黑皮雞樅菌株發酵液對ABTS自由基有一定的清除能力。在相同稀釋倍數下，菌株HP1 發酵液的清除率最高，為54.28%；其次是HP2、HP4 菌株，清除率為52.88%、52.73%；其余菌株的清除率均低于52%。

表5 不同黑皮雞樅菌株發酵液對氧化活性物質的清除率 單位：%

2.3.2.2 DPPH自由基清除能力

由表5 可知，黑皮雞樅菌株發酵液對DPPH 自由基有一定的清除能力。在相同稀釋倍數下，菌株HP1發酵液的清除率最高，為78.08%，明顯高于其他菌株；其次是HP7、HP2 菌株，清除率為75.81%、74.90%；其余菌株的清除率均低于74%。

2.3.2.3 羥自由基清除能力

由表5可知，黑皮雞樅菌株發酵液對羥自由基有一定的清除能力。在相同稀釋倍數下，菌株HP2、HP3發酵液的清除率最高，分別為69.53%、68.10%，兩者略有差異，但差異不顯著；其次是HP1、HP5菌株，清除率為66.06%、65.80%；其余菌株的清除率均低于65%。

2.3.2.4 還原能力分析

由圖1 可知，黑皮雞樅菌株發酵液對鐵離子有一定的還原能力，其中菌株HP1 的吸光度最大，為0.598，顯著高于其他7 個菌株，還原力最強；其次是HP3、HP7，吸光度為0.560、0.555；其余菌株的吸光度均低于0.550。

圖1 不同黑皮雞樅菌株發酵液的還原能力

3 小結與討論

本研究結果表明，不同黑皮雞樅菌株的菌絲生長速度、菌球干重、抗氧化成分含量及抗氧化活性存在差異，這與張越野對不同靈芝誘變菌株抗氧化活性研究結果一致，誘變菌株A14、A19的DPPH自由基清除率、鐵離子還原能力、ABTS 自由基清除能力顯示出較強的抗氧化活性[16]；也與曲德輝篩選桑黃優良菌株的研究結果一致，在7 個桑黃菌株中篩選出了1 株菌絲生長活力、發酵生物量、抗氧化能力均優于其他6個菌株的優良菌株SH1[17]。綜合不同菌株的菌絲生長速度、菌球干重、抗氧化成分及活性結果，HP1菌絲活力強，菌球干重大，為0.827 1 g·(100 mL)-1，還原糖含量為50.29 mg·mL-1，可溶性蛋白含量為38.47μg·mL-1；抗氧化物質含量高，總酚、總黃酮含量為240.12、23.23 μg·mL-1，抗氧化能力最強，其稀釋液對ABTS自由基、DPPH自由基、羥自由基的清除率為54.28%、78.08%、66.06%，對鐵離子的還原能力最強，吸光度為0.598。研究結果表明黑皮雞樅HP1 菌株是8 株黑皮雞樅菌株中抗氧化能力最強的菌株，可用于后續黑皮雞樅抗氧化產品的開發利用。