LC-MS/MS法測定網售外用乳膏中的10種抗菌藥物

李冬云 陳思婷 陳立波 周 穎 盧森華

（1.玉林市食品藥品檢驗檢測中心，玉林中藥材（含香辛料）質量監測與評價工程技術研究中心，玉林 537000；2.桂林醫學院，桂林 541199）

近年來，隨著人民物質生活水平有所提升，對皮膚類產品的需求也日益提高，許多網售的宣傳可以治療手足蘚、皮疹、腳氣等止癢抑菌外用乳膏都被賦予除癢止癢、抑菌殺菌、保濕滋潤的希望和功效。網售的外用乳膏大多為消字號產品，價格低廉、購買和使用方便、針對性強，民眾廣泛接納，因此不法經營者通過在其產品中添加抗菌藥品來達到快速治療的目的。但隨著監管的要求和對質量安全的重視，更多的消費者期望能使用到有效且安全的外用乳膏。

外用乳膏添加的抗菌藥物包括抗真菌類、抗生素類等，檢測方法主要有液相質譜聯用法和液相法[1-8]等，液相法僅靠保留時間定性，抗干擾能力差且靈敏度低，較難滿足非法添加組分殘留檢測要求。液質法可同時測定多個目標物，具有高選擇性、高靈敏度、高通量的優勢，可彌補液相方法的不足，因此該技術在藥品安全分析中得到廣泛應用。氟康唑、酮康唑、萘替芬、聯苯芐唑、克霉唑、益康唑、灰黃霉素、咪康唑 、特比萘芬是在外用乳膏中是最常發現的非法添加抗真菌類藥物，莫匹羅星是常見的外用抗生素，這10種抗菌藥物在臨床上對治療皮膚濕疹、皮炎、瘙癢等效果較好，但是如果長期使用會產生耐藥性和身體危害。其中陸林玲[9]等建立的超高效液相色譜-串聯質譜法測定化妝品中38種抗菌藥，沙麗娜[10]等建立的液質聯用法測定化妝品中16種抗菌藥物，主要研究的是抗生素類和抗真菌類成分，并未涵蓋特比萘芬和莫匹羅星，且磺胺類和喹諾酮類等抗生素鮮有添加?，F有方法未能同時涵蓋這10種藥物，本實驗在上述檢測方法的基礎上，采用HPLC-MS/MS法，多反應監測，更有針對性的實現快速準確測定外用乳膏可能添加的10種抗菌藥物，為其以及相關產品中的非法添加抗菌藥物的監測提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氟康唑等8種（氟康唑、酮康唑、萘替芬、聯苯芐唑、克霉唑、益康唑、咪康唑、灰黃霉素）混合標準品溶液，濃度100 μg/mL，批號:S074153，Medjen邁迪嘉（天津）科技有限公司；鹽酸特比萘芬，批號：NL201104-10，斯坦?；瘜W公司，含量98.13%；莫匹羅星，130568-202102，中國食品藥品檢定研究院，含量100%；甲酸：優級純，上海安譜科科學儀器有限公司；乙腈，色譜純，Merck公司；水為超純水；其它所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

液相色譜-質譜聯用儀：Xevo-TQ-Smicro型，美國沃特世公司；電子分析天平：XS-205DU型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；數控超聲波清洗器：KQ-250DB型，昆山市超聲儀器有限公司；超純水儀：Milli-Q型，美國Millipore公司；可調量程移液槍：量程為100 μL～1000 μL、10μL～100μL，賽默飛公司。

1.3 樣本來源

實驗中使用的外用乳膏，隨機采購于網絡銷售平臺，共47批，涵蓋嬰幼兒濕疹產品和草本類止癢抑菌類產品等，樣品編號為1～47。

1.4 試驗方法

1.4.1 標準溶液配制

標準儲備溶液的配制：分別精密稱取莫匹羅星對照品11.53 mg、鹽酸特比萘芬對照品17.25 mg分別置于不同的50 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為單標儲備液；分別精密量取莫匹羅星對照品單標儲備液、鹽酸特比萘芬單標儲備液各0.5 mL置于同一個50 mL量瓶中，加乙腈稀釋配制成2種成分的混合標準儲備溶液；精密量取氟康唑等8種混合標準品溶液（100 μg/mL）1.00 mL至20 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為另外8種成分的混合標準儲備溶液。

標準工作溶液：使用可調量程移液槍(量程分別為:100 μL～1000 μL、10 μL～100 μL)分別精密量取莫匹羅星和鹽酸特比萘芬的混合標準儲備液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1 mL，及另外8種成分的混合標準儲備溶液0.04 mL、0.08 mL、0.16 mL、0.32 mL、0.4 mL分別置于5個10 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為系列標準工作溶液。

1.4.2 樣品制備

稱取供試品0.5 g置于50 mL離心管，加飽和NaCl 1 mL，渦旋30 s，加入乙腈20 mL，渦旋30 s，超聲處理30min，放冷至室溫，最后用乙腈定容至刻度，以5000r/min離心5 min，上清液經0.22 μm濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

1.4.3 色譜-質譜條件

色譜條件：色譜柱為phenomenex Kinete C18（100mm × 4.6 mm × 2.6 μm）; 柱溫：35℃；進樣體積：5 μL；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈，流量為0.3 mL／min，梯度洗脫，洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序

質譜條件：離子模式： ES+：;毛細管電壓：2.50kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；錐孔氣流速：20 L/h；脫溶劑氣流量：1000 L/h。表2列出了多反應監測掃描參數。

表2 多反應監測掃描參數

2 結果與討論

2.1 液相色譜-質譜條件的優化

基于10種成分中，氟康唑、酮康唑、聯苯芐唑、克霉唑、益康唑、咪康唑為三唑類結構，萘替芬和特比萘芬為烯胺類結構，灰黃霉素為多烯類結構，莫匹羅星疏水性較強，這些成分均微溶于水或難溶于水，易溶于甲醇和乙腈的物理性質，所以實驗選擇了反相色譜常用的流動相體系甲醇-水和乙腈-水。又考慮到在質譜正離子模式下，甲酸可使目標物形成［M+H］+，有助于促進質子離子化，從而提高分析靈敏度。因此本實驗著重考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時各物質的分離效果。實驗結果表明，乙腈-0.1%甲酸水流動相體系效果最佳，靈敏度更高，且峰形尖銳對稱，分離度好；因此本實驗選用乙腈-0.1%甲酸水作為最佳流動相體系。在優化色譜條件下，10種組分的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 10種組分的總離子流圖

用標準儲備溶液在流動注射泵進樣方式下，在電噴霧離子源的正離子模式和負離子模式下，分別對質量濃度為2 μg/mL混合標準溶液進行一級質譜全掃描分析，獲得準分子離子或加合離子。掃描結果表明：在負離子模式下大部分目標物質離子的相對豐度多數不到正離子模式下的1/2；因此，實驗在正離子模式下進一步優化質譜條件，通過改變碰撞能量和錐孔電壓，選擇信號較強、干擾較小的子離子對，其中豐度相對較大的為定量離子，另一個為定性離子。

2.2 標準工作曲線、檢測限及定量限（表3）

表3 10種藥物的線性范圍、回歸方程、檢出限與定量限

2.3 回收率

稱取外用乳膏陰性樣品9份，分別添加3個濃度水平，每個水平添加3個平行，按照1.4.3的方法測定10種藥物的濃度，加標回收率及其相對標準偏差，見表4。由結果看出，該方法的準確性良好。

表4 3個水平濃度添加回收率試驗結果

2.4 精密度試驗

取外用乳膏陰性樣品，加入濃度約為3 μg/mL的莫匹羅星和特比萘芬混合儲備液和濃度為5 μg/mL的其余8種成分的混合儲備液各1 mL，按照“ 1.4.2 ”進行前處理，平行測定6次，記錄峰面積，結果顯示氟康唑、酮康唑、萘替芬、聯苯芐唑、克霉唑、益康唑、灰黃霉素、咪康唑 、特比萘芬、莫匹羅星的峰面積的精密度RSD為1.67%、1.18%、1.04%、0.86%、0.83%、1.02%、1.30%、0.98%、0.48%、0.62%，表明該方法精密度良好。

2.5 重復性試驗

取外用乳膏陰性樣品6份，加入濃度約為3μg/mL的莫匹羅星和特比萘芬混合儲備液和濃度為5 μg/mL的其余8種成分的混合儲備液各1 mL，按照“ 1.4.2 ”進行前處理，制成6份樣品溶液，按“ 1.4.3 ”中的方法進行測定，記錄峰面積，結果顯示氟康唑、酮康唑、萘替芬、聯苯芐唑、克霉唑、益康唑、灰黃霉素、咪康唑、特比萘芬、莫匹羅星的精密度RSD%為0.60%、0.46%、1.86%、1.22%、1.65%、1.18%、1.34%、0.92%、1.64%、1.49%，表明該方法重復性較好。

2.6 定性確證

本試驗采用樣品保留時間與標準物質保留時間一致（保留時間偏差在±2.5%范圍內），且定性與定量離子對相對離子豐度比滿足表5要求，判定為檢出。

表5 相對離子豐度比最大允許偏差

2.7 樣品測定結果

應用本方法對網售的47批外用乳膏進行了分析測定，其中1批檢出灰黃霉素、1批檢出酮康唑、16批檢出咪康唑、2批檢出聯苯芐唑、10批檢出特比萘芬，檢出率如圖2所示，由圖可知，網售47批外用乳膏檢出率較高前3種組分依次為為咪康唑、特比萘芬、聯苯芐唑，其中咪康唑檢出率高達34%；檢出的含量均較高，甚至高達毫克級別，具體數值見表6。

圖2 檢出組分及檢出率%

表6 樣品檢出情況

mg·g-1

3 結語

采用液相色譜儀串聯質譜法，對網售外用乳膏中的10種抗菌藥物進行快速定量定性分析。本方法靈敏度高，專屬性強，能準確定量并同時測定多種藥物，滿足目標分析物的定性和定量要求，為開展網售外用乳膏非法添加的檢測及風險評估，加強化妝品質量監管提供技術支持。