HPLC-MS/MS法測定新疆“ 涼皮、涼面 ”中3種真菌毒素

閆順華 蘇比努爾·巴克 麻小圓 滕文革

（1.新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院，烏魯木齊 830054；2.新疆昌吉州疾病預防控制中心，昌吉831100）

1 前言

真菌毒素是真菌產生的有毒次生代謝產物,對肝臟、腎臟、造血系統、免疫系統和生殖系統有嚴重的毒性，同時還有致癌、致突變、致畸等作用[1，2]。聯合國糧食及農業組織( FAO)估計每年有高達25%的糧食受到真菌毒素的污染，而實際上真菌毒素污染的發生率在60%～80%左右[3，4]。谷物在種植、收獲、運輸及儲藏過程中都可能遭受產毒真菌污染，受到污染谷物往往同時含有多種真菌毒素，多種真菌毒素共存通常會產生協同毒性增強效應[5]。有研究證實,低于國家食品安全限量標準的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇( DON，又稱嘔吐霉素)、玉米赤霉烯酮( ZEN ) 和黃曲霉毒素B1(AFB1)共存時能造成細胞代謝的嚴重紊亂[6，7]。

針對真菌毒素污染，我國制定了GB 5009.22-2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》[8]、5009.111-2016《食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》[9]和5009.209-2016《食品安全國家標準 食品中玉米赤霉烯酮的測定》[10]分別用來測定食品中的黃曲霉毒素B族及G族、DON及其衍生物和ZEN。由于食品中多種真菌毒素可能同時存在[11]，在國家和省級食品監督抽驗過程中，針對不同的真菌毒素，同一批次的樣品需要采用不同的前處理方法處理多遍，成本高，又費時費力，因此開發高效的多功能免疫親柱和同時檢測多種真菌毒素的檢測方法是需要不斷深入研究的重要課題。SN/T 3136-2012[12]采用液質聯用儀可同時測定8種真菌毒素，但不包含ZEN。目前，關于利用液質聯用儀同時測定食品中多種真菌毒的研究在不斷深入。

涼皮、涼面和涼粉（文中統稱新疆“ 三涼 ”）是新疆各族群眾喜食的地方性小吃之一，其制作原料為小麥粉，本實驗以新疆涼皮、涼面為樣本，采用高效液相色譜-質譜/質譜聯用儀，探索同時測定食品中DON、ZEN和AFB1的檢測方法，以期為食品監督抽檢提供借鑒和參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜-質譜聯用儀：I-Class/Xevo TQS, 美國Waters公司；電子天平：百分之一，Mettler Toledo公司；粉碎機：HGB550，上海凌初環保儀器有限公司；多通量均質器：Ck1000，美國Thmorgan公司；AFB1/ZEN/DON三合一免疫親和柱：北京華安麥科生物技術有限公開發中心。

DON對照溶液：100 μg/mL，BePure，批號-25328-010，北京曼哈格生物科技有限公司；ZEN對照溶液：100 μg/mL，批號-271829，德國Witega公司；AFTB1對照溶液：100 μg/mL，批號-S078495,FirstStandard，天津阿爾塔科技有限公司。

甲醇：色譜純，美國Fisher公司；乙腈：分析純，天津北辰方正化學試劑廠；吐溫-20：分析純，福辰（天津）化學試劑有限公司；鹽酸和乙酸：天津北聯精細化工有限公司；稀釋液：PBS磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH為7.2～7.4)，武漢卡諾斯科技有限公司。超純水。

提取液：80%乙腈水溶液；洗滌液：0.1%吐溫-20水溶液。

2.2 試樣

2.2.1 樣品來源

涼皮、涼面樣品來源于《食品安全地方標準 新疆“ 三涼 ”》項目組抽取的90批樣品，質控樣品購置于北京美正生物科技有限公司生產的小麥粉中DON、ZEN和 AFB1分析質控樣品。

2.2.2 樣品預處理

將不同批次的樣品分別用高速粉粹機進行粉粹，混勻后從中抽取100克左右，分別儲存于兩個樣品袋中，貼簽，冷藏保存，待處理。

2.2.3 樣品提取

稱取5 g試樣（精確至0.01 g），加入25 mL乙腈-水溶液（80+20），渦旋混勻，置于搖床（200 r/min～300 r/min）劇烈振蕩20min，用快速定性濾紙過濾，取10 mL濾液加入70 mLPBS稀釋液稀釋，混勻。用微纖維濾紙過濾至澄清,濾液待凈化。

2.2.4 凈化洗脫

事先將低溫保存的三合一免疫親和柱恢復至室溫。待將免疫親和柱內原有液體流盡后，準確移取上述濾液20 mL，注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與玻璃注射器相連接，調節下滴速度，控制樣液以每秒1～2滴的流速通過免疫親和柱；待液體排干后，用10 mL洗滌液和10 mL超純水依次洗滌免疫親和柱，流速約為每秒2～3滴；待液體排干后，加入2 mL洗脫液（乙酸：甲醇=2：98），堵上親和柱下方堵頭，靜置3 min，控制每秒1滴的下滴速度，收集洗脫液；將洗脫液在50 ℃下用氮氣吹至近干，加入2.0 mL初始流動相，渦旋30 s溶解殘留物，0.22 μm濾膜過濾，收集濾液于進樣小瓶中，待測。

2.2.5 方法檢出限、定量限及加標樣品制備

（1）方法檢出限制備

稱取5 g陰性三涼樣品置于三角燒瓶中，分別加入10 ng/mL的AFB1標準溶液15 μL、100 ng/mL的ZEN標準溶液50 μL、1000 ng/mL的DON儲備液50 μL，按樣品同法制備。

（2）定量限及加標樣品制備

本方法以定量限（即AFB1為0.1 μg/kg、ZEN為4 μg/kg、DON為20 μg/kg）加標作為樣品的低濃度加標，以3種真菌毒素的限量值（即AFB1為5 μg/kg、ZEN為60 μg/kg、DON為1000 μg/kg）作為樣品的一個加標濃度，然后根據標曲線性范圍選擇另外一個點的加標濃度。

稱取5g陰性三涼樣品，分別加入10 ng/mLAFB1標準溶液50 μL、1000 ng/mLZEN和DON儲備液20μL、 100 μL，按樣品同法制備，得到3種真菌毒素的定量限加標溶液，。

稱取5g陰性三涼樣品，分別加入1000 ng/mL AFB1標準溶液25 μL、1000 ng/mLZEN標準溶液0.3 mL、100 μg/mLDON對照原液12.5 μL，按樣品同法制備，得到3種真菌毒素的限量值加標溶液。

稱取5g陰性三涼樣品，分別加入1000 ng/mL AFB1標準溶液50 μL、100 μg/mLZEN和DON儲備液25 μL、16 μL，按樣品同法制備，得到AFB1為10 μg/kg、ZEN為500 μg/kg、DON為320 μg/kg的加標溶液。

2.2.6 質控樣品處理

稱取5g質控樣品（精確至0.01 g），按樣品制備方法處理。

2.3 標準溶液配制

2.3.1 標準儲備液配制

分別精密量取0.10 mLAFB1、ZEN 和DON標準溶液至3個10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到濃度為1000 ng/mL的標準儲備液。

2.3.2 標準中間液配制

精密量取1000 ng/mLAFB1的儲備液1.00 mL至10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到濃度為100ng/mL AFB1的標準中間液。

2.3.3 混合標準工作液系列配制

分別精密量取不同體積的AFB1的標準中間液、ZEN和DON標準儲備液至7個10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到濃度為0.025、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL的AFB1工作液系列，1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100、200 ng/mL的ZEN工作液系列，5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160、320 ng/mLDON的標準工作液系列。

2.4 液質聯用儀工作條件

色譜柱： ACQUITY UPLC? BEH C18，(2.1×100 mm,1.7 μm)；流動相： 0.1%甲酸溶液（A相）+0.1%甲酸乙腈（B相），梯度洗脫條件見表1；流速：0.3 mL/min；電離模式：ESI；掃描方式：正負離子掃描；檢測方式：MRM ，質譜條件見表2；進樣量：10.0 μL 。

表1 液相色譜儀梯度洗脫條件

表2 3種真菌毒素質譜條件

2.5 3種真菌毒素總離子流圖（圖1）

圖1 3種真菌毒素總離子流圖AFB1為0.05 ng/mL、ZEN為5.0 ng/mL、DON為10.0 ng/mL

3 結果與分析

3.1 色譜條件的優化

實驗對流動相考察了水-甲醇、水-乙腈、5 mmol乙酸銨-乙腈、0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈，結果表明0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈的整體分離效果和峰形都比較好，因此，選擇0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相，進行梯度洗脫，在7 min內對3種毒素進行分離。

3.2 線性方程、方法檢出限和定量限

用LC-MS/MS對2.3.3項下的混合標準工作液系列進行測定，每個濃度重復測定2次，以相對應的響應值為縱坐標（y），以標準工作液的濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，計算回歸方程。對2.2.5項下的方法檢出限樣品進行測定，3種真菌毒素的信噪比均大于3；對加標樣品進行測定，帶入標曲方程計算，可得到方法定量限及加標回收率。檢測結果見表3和表4。

表3 3種真菌毒素的標曲方程、相關系數、檢出限和定量限

表4 3種真菌毒素加標回收率（n=6）

從表3可以看出，3種真菌毒素在一定范圍內呈良好的線性關系，相關系數均大于0.999。本方法中AFB1、ZEN和DON的檢出限和定量限分別與5009.22-2016、5009.111-2016和5009.209-2016中的液相色譜-串聯質譜法所給出的檢出限和定量限一致，因此本研究建立的方法能夠滿足上述國家標準對3種真菌毒素的檢測要求。

3.3 方法回收率

按照GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》[13]中的質量控制要求，當被測組分含量小于0.1 μg/mL(即小于100 μg/mL)時，回收率應在60%～120%的范圍內；當被測組分含量在0.1～1 μg/mL(即含量在100～1000 μg/mL范圍內時，回收率應在80%～110%的范圍內，據此，表4中3種真菌毒素低、中、高的回收率均符合要求。

用單組分的免疫親和柱分別對樣品進行前處理，測得AFB1、ZEN和DON的回收率分別在96%～102.7%、98.2%～101.4%、99.1%～100.8%之間，3種真菌毒素低、中、高回收率都比較高。從三合一的免疫親和柱測定結果來看，AFB1的回收率相對較低，一方面可能與AFB1加標濃度較低，前處理時損失相對較大有關；另一方面也可能是三合一的免疫親和柱對不同真菌毒素的凈化萃取效率有差異。

3.4 樣品分析

從90批次三涼樣品中隨機抽取5批次涼面、5批次涼皮，按本方法樣品前處理方法制備后，經LC-MS/MS分析，結果表明10批次樣品中均不含有AFB1，DON的含量范圍在5.46 μg/kg～13.524 μg/kg之間，ZEN的含量范圍在1.124 μg/kg～2.356 μg/kg之間，DON和ZEN雖然在樣品中微量存在，但二者的含量均低于本方法的定量限（DON的定量限為20 μg/kg、ZEN的定量限為4 μg/kg），實際測定結果是3種真菌毒素均未檢出。

3.5 質控樣分析

用AFB1/ZEN/DON三合一免疫親和柱對質控樣處理后上機測定，3種質控樣品的測定結果均在滿意值范圍內，一方面說明所使用的三合一的免疫親和柱的萃取效率滿足要求，另一方面也證明了本方法的適用性。結果見表5。

表5 質控樣測定結果

多合一的免疫親和柱對不同真菌毒素的柱容量是不同的，本方法中使用的三合一免疫親和柱對AFB1的柱容量為300 ng、對ZEN和DON的柱容量均為2000 ng，在處理加標樣品和質控樣時，應根據柱容量選擇合適的加標濃度、調整適當的上樣液的體積。

4 結論

本實驗建立了LC-MS/MS同時測定食品中AFB1、DON、ZEN的檢測方法，方法的檢出限、定量限和加標回收率均滿足相關國家標準要求，質控樣的測定值均在滿意值范圍之內，說明建立的方法是可行的。該方法處理一次樣品就可同時測定3種真菌毒素，相對于同一樣品要分別處理3次、測定3次的現行國家標準，節約了時間，大大提高了檢驗效率。目前，七合一的免疫親和柱已經出現，一支免疫親和柱可同時萃取凈化的組分越多，價格也越高，對不同真菌毒素萃取效率不均衡的現象也越明顯。因此，在下一步的工作中，探索研究價格低廉的通用型固相萃取柱對食品中多種真菌毒素的提取凈化方法是非常有意義的[14，15]。