反相高效液相色譜法測定刺五加葉中綠原酸和金絲桃苷含量

田國賀 趙艷 孫海濤 韓松濤 韓曉紅 逄煥歡

【摘要】目的：建立HPLC法定量分析東北地區不同產地刺五加葉中綠原酸和金絲桃苷的含量。方法：采用三種不同品牌C18色譜柱，流動相A為0.3%磷酸溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫：0～3 min，95%A；3～10 min，95%～80%A；10～40 min，80%A；40～50 min，80%～10%A；流速1.0 mL/min；柱溫35℃；進樣量5μL；檢測波長為354 nm。結果：綠原酸和金絲桃苷分別在0.39～5.9μg、0.08～1.2μg范圍內呈良好的線性關系；精密度、穩定性、重復性試驗RSD<1.1%，綠原酸和金絲桃苷的加樣回收率分別為102.3%、98.4%。不同產地樣品綠原酸含量范圍為1.01 mg/g～10.71 mg/g；金絲桃苷含量范圍為0.25 mg/g～1.49 mg/g。結論：建立的HPLC法可有效考察刺五加葉中多成分含量，不同地區間刺五加葉中綠原酸和金絲桃苷含量有差異。

【關鍵詞】刺五加葉；綠原酸；金絲桃苷；反相高效液相色譜法

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.06.027

【基金項目】2023年吉林省中醫藥科技項目：中藥材（中藥飲片）刺五加葉質量評價的研究（2023075）。

Determination of Chlorogenic Acid and Hyperin in Acanthopanax Senticosus Leaves by Reversed Phase High-performance Liquid Chromatography

TIAN Guohe， ZHAO Yan， SUN Haitao， HAN Songtao， HAN Xiaohong， PANG Huanhuan*

（Jilin Provincial Institute for Drug Control and Research， Changchun 130000， China）

Abstract： Objective：To establish a HPLC method for quantitative analysis of chlorogenic acid and hyperoside in the leaves of acanthopanax senticosus from different areas in northeast of China. Method： Three different brands of C18 chromatographic columns were used， with mobile phase A being 0.3% phosphoric acid solution and mobile phase B being acetonitrile. Gradient elution： 0～3 minutes， 95% A； 3～10 minutes， 95%～80% A； 10～40 minutes， 80% A； 40～50 minutes， 80%～10% A； Flow rate 1.0 mL/min； Column temperature 35℃； Injection volume 5μL； Detection wavelength is 354 nm. Results： Chlorogenic acid and hyperoside showed a good linear relationship in the range of 0.39～5.9μg and 0.08～1.2μg； The RSD of precision， stability and repeatability test is less than 1.1%， and the recovery of chlorogenic acid and hyperoside are 102.3% and 98.4% respectively. The content of chlorogenic acid in samples from different areas ranges from 1.01 mg/g to 10.71 mg/g； The content range of hyperoside is 0.25 mg/g to 1.49 mg/g. Conclusion： The established HPLC method can effectively investigate the content of multi-component in the leaves of acanthopanax senticosus， and the content of chlorogenic acid and hyperoside is different in different regions.

Key words： acanthopanax senticosus leaves； chlorogenic acid； hyperoside； reversed phase high-performance liquid chromatography

刺五加是我國東北地區道地藥材，東北三省的產量占全國總產量的90%以上[1]。各版《中華人民共和國藥典》中刺五加藥用部位為根、根莖及莖，同時近年文獻也多集中在根及根莖的研究報道，刺五加作為藥食同源的植物，史料中記載刺五加葉也可入藥[2]。由于具有廣泛的藥用價值，導致野生刺五加資源遭受了嚴重的破壞，已被國家列為三級保護漸危品種。刺五加葉具有可再生性，但受藥品標準規定限定，刺五加葉加工的產品多應用于保健品和功能性食品，因此有必要開展對刺五加葉活性成分的研究。

目前，我國對于刺五加的人工栽培主要集中在東北長白山，松花江等地區。刺五加葉主要成分為黃酮類、木脂素類、苯丙素類和多糖[3-4]，本文通過對東北地區不同產地刺五加葉的質量研究考察中發現，其中綠原酸和金絲桃苷含量較高。為進一步了解不同產地的刺五加葉質量，本文建立HPLC法同時測定其中綠原酸及金絲桃苷含量。

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，SPD-M20A型DAD檢測器；Mettler MS105型精密天平。

綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110753-202119）；金絲桃苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111521-202310）。乙腈為色譜純（德國MERCK公司），水為屈臣氏蒸餾水，其他試劑均為分析純。

刺五加葉來源于吉林省長白山十五道溝、靖宇縣泉陽鎮和輝南縣小城子村、黑龍江省松江河老松江村和尚志市亞布力鎮，共收集10批樣品，經我院中藥室專家鑒定為五加科植物刺五加的干燥葉。

2.1色譜條件

本試驗考察了Sepax Amethyst C18-H（250×4.6 mm，5μm）柱；Waters SunFire C18 （4.6×250 mm，5μm）柱；Agilent Zorbax SB-C18 （250×4.6 mm，5 +m）柱，三種色譜柱在正文色譜條件下，測定同一供試品溶液（長白山十五道溝）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：354 nm；柱溫：35℃；流動相A：0.3%磷酸溶液，流動相B：乙腈，梯度程序如表1所示。

2.2系統適應性考察

在“2.1色譜條件”下，各色譜柱刺五加葉中綠原酸和金絲桃苷的理論塔板數分別為183170、134868、154879，綠原酸與相鄰峰的分離度分別為13.263、14.459、15.297，金絲桃苷與相鄰峰的分離度分別為1.501、1.623、1.609，且色譜圖峰形對稱。

2.3對照品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸和金絲桃苷對照品適量，加甲醇制成綠原酸和金絲桃苷的濃度分別約為0.4 mg/mL和0.08 mg/ mL的混合對照溶液，即得。

2.4供試品溶液的制備

取刺五加葉粗粉（過100目）1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，稱重，超聲處理30 min，放冷，再稱重，用75%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.5線性關系考察

精密吸取對照品溶液1μL、2μL、5μL、8μL、10μL、15μL，分別注入液相色譜儀，記錄峰面積。

以對照品溶液濃度（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，綠原酸標準曲線回歸方程為：Y=928163X+76471，r=0.9990，進樣量范圍為0.39～5.9μg；金絲桃苷標準曲線回歸方程為：Y=2131967X-1022，r=0.9999，進樣量范圍為0.08～1.2μg。

2.6穩定性試驗

取刺五加葉（長白山十五道溝村）粗粉1.0 g，精密稱定，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h進樣5μL，依法測定綠原酸和金絲桃苷的峰面積值。結果綠原酸和金絲桃苷峰面積24小時內RSD分別為0.14%和0.22%，表明樣品在制備供試品溶液后24 h內穩定。

2.7重復性試驗

取刺五加葉（長白山十五道溝村）粗粉1.0 g，精密稱取6份，每份約1.0 g，照“2.4”項下方法制備供試品溶液，依法進行測定。結果綠原酸含量為9.52 mg/g，RSD=1.05%；金絲桃苷含量為1.47 mg/g，RSD=1.1%，表明本測定方法的重復性良好。

2.8回收率試驗

稱取刺五加葉（長白山十五道溝村）粗粉0.5 g，精密稱取6份，置具塞錐形瓶中，精密加入高中低濃度的各組分標準溶液，照“2.4”項下方法制備供試品溶液，依法進行測定，計算。結果綠原酸和金絲桃苷的平均加樣回收率分別為102.3%和98.4%，RSD分別為0.5%和1.1%。

2.9實際樣品測定

分別精密稱取5個產地兩批次的刺五加葉粗粉各約1.0 g，照“2.4”項下方法制備供試品溶液，具體數據見表2。不同產地樣品綠原酸含量范圍為1.01 mg/g～10.71 mg/g；金絲桃苷含量范圍為0.25 mg/g～1.49 mg/g。吉林省長白山區域基地所產樣品含綠原酸及金絲桃苷均較高。

3.1波長

本文采用二極管陣列檢測器，其中紫外光譜圖顯示綠原酸在218 nm和327 nm波長處是最大吸收波長，金絲桃苷在255 nm和354 nm波長處是最大吸收波長。考慮綠原酸在354 nm波長處響應值仍較高，故選擇354 nm波長處為測定波長。

3.2供試品制備方法

本文采用了75%乙醇、95%乙醇及75%甲醇和100%甲醇作為供試品提取溶劑，分別超聲處理，結果以75%乙醇超聲時綠原酸和金絲桃苷的樣品含量最高，分別為9.54 mg/g和1.47 mg/g。

同時采用浸泡24小時后超聲30分鐘、超聲30分鐘、超聲60分鐘三種處理方式，結果綠原酸和金絲桃苷的樣品含量基本無差距，確定處理方式為操作簡便的超聲處理30分鐘。

【參考文獻】

[1]張順捷，李曉琳.刺五加資源的開發利用[J].中國食品藥品監管，2021（5）：108-111.

[2]徐春玲.刺五加葉活性成分研究及其產品開發[D].長春：吉林農業大學，2012.

[3]王晶瑤.刺五加和短梗五加葉及果鎮靜催眠活性對比研究[D].長春：吉林農業大學，2020.

[4]關欣，秦雯，謝百波，等.一測多評法測定刺五加葉中5個酚類成分含量的研究[J].北京城市學院學報，2021（1）：69-73.

【作者簡介】

田國賀，女，1982年出生，副主任藥師，研究方向為藥品檢驗與研究。

通訊作者：逄煥歡，女，1977年出生，副主任藥師，研究方向為藥品檢驗與研究，郵箱：1480325014@qq.com。

（編輯：侯睿琪）