2022年天津地區魚源氣單胞菌耐藥性分析

趙良煒,張振國,徐赟霞,王 禹,張 麗

(天津市動物疫病預防控制中心,天津 300402)

隨著水產養殖業的發展,水產養殖病害成為制約水產養殖業發展的一個重要問題,2019年和2020年我國水產養殖因疾病造成的經濟損失分別為408億元和589億元,而細菌性疾病所占比例最高[1-2]。2020年天津地區淡水養殖面積22 731 hm2,淡水養殖總產量23.7萬噸,總產值54.0億元,其中草魚、鰱、鳙、鯉、鯽等大宗淡水魚養殖產量18.6萬噸,占淡水養殖產量的78.5%[3]。根據2019年、2020年水產養殖動物病情測報監測結果,池塘養殖魚類細菌性疾病發病率分別占病害發病總數的50.0%和53.3%[1-2]。2022年農業農村部《關于做好2022年水產綠色健康養殖技術推廣“五大行動”工作的通知》中要求繼續做好水產養殖用藥減量行動,而對水生動物病原菌耐藥性監測是用藥減量行動的重要環節。

通過流行病學調查顯示,氣單胞菌屬(Aeromonas)細菌是鯉、鯽、草魚等大宗淡水魚細菌性疾病的主要致病源。氣單胞菌屬細菌廣泛分布于水環境中,是一種條件致病菌,可以引起水產動物多種疾病,如細菌性敗血癥、細菌性爛鰓、腸炎等,對我國水產養殖業造成巨大損失。抗生素治療是針對此類疾病的首選方法,當前水產養殖用藥及用藥指導是以國家漁藥標準為基礎,缺乏對水產養殖動物致病菌的耐藥性監測及致病菌耐藥性變化的數據,再加上藥物的濫用、誤用等不合理用藥情況普遍存在,致使細菌耐藥性日益嚴重。因此,針對氣單胞菌病進行病原菌耐藥性監測,對水產養殖業的健康發展具有重要意義:可以針對水產病原菌耐藥性及其變化的規律,在養殖過程中科學選擇和使用藥物;可以避免濫用藥物,為水產品的質量安全奠定了基礎;可以控制細菌耐藥性的產生及傳遞,降低將耐藥性傳播給人類致病菌的潛在風險,維護公共衛生安全。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 2020—2022年4—10月,每月采集發病樣品,樣品包括草魚、鰱、鳙、鯉、鯽等大宗淡水魚,取樣部位為肝、脾、腎、腹水。

1.1.2 生化試劑 營養瓊脂、腦心浸液瓊脂(BHI)購自英國Oxoid公司,革蘭氏染液試劑盒、氧化酶試紙以及生化鑒定管均購自北京陸橋技術有限責任公司,梅里埃生化鑒定試劑卡GN及配套試劑購自法國梅里埃公司,藥敏預制板購自南京菲恩生物科技有限公司,DL2000 DNA marker、核酸染料、瓊脂糖購自Takara,PCR引物27F:(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、1492R:(5’-TACGACTTAACCCCAATCGC-3’)蘇州金唯智合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的生化鑒定 細菌生化鑒定采用梅里埃VITEK Compact2 進行,并補充革蘭氏染色、氧化發酵試驗、氧化酶試驗、硫化氫、葡萄糖產氣、V-P試驗等。

1.2.2 細菌的分子鑒定 細菌16S rRNA分子生物學鑒定按照曹青等[4]的方法進行。

1.2.3 細菌最小抑菌濃度(MIC)測定 細菌最小抑菌濃度測定采用微量稀釋法進行,操作方案按照南京菲恩藥物預制板說明書進行,質控菌株使用大腸桿菌(ATCC29522),測定藥物均為允許使用的國標漁藥。

1.3 數據分析

根據藥敏試驗結果, 采用 SPSS 計算各抗菌藥物對分離菌株的 MIC50和 MIC90( 分別指抑制50% 和90%分離菌株生長所需要的MIC)。

2 結果

2.1 氣單胞菌分離鑒定結果

氣單胞菌屬細菌在BHI瓊脂平板上菌落呈淡黃色,圓形,表面光滑、微凸,革蘭氏染色為陰性,氧化發酵陽性,氧化酶陽性,部分菌株生化鑒定結果見表1。分子鑒定通過對分離菌株進行16s rRNA擴增,將條帶大小與目的條帶一致的菌株經測序、BIAST比對確定到種屬。2022年從寶坻、寧河區等地區人工養殖鯉、鯽、鰱、鳙、草魚等發病魚體內共分離獲得氣單胞菌屬細菌60株,其中嗜水氣單胞菌32株,溫和氣單胞菌18株,維氏氣單胞菌8株、豚鼠氣單胞菌2株(分類占比見圖1)。

表1 部分菌株部分生化試驗結果

圖1 2022年氣單胞菌分離情況

2.2 氣單胞菌屬細菌耐藥性總體情況

2022年分離的60株氣單胞菌對抗菌藥物的感受性分布情況見表2、表3所示。分離菌株對恩諾沙星的感受性最低,其MIC50為0.12 μg/mL,MIC90為1.58 μg/mL;其次為鹽酸多西環素,其MIC50為0.27 μg/mL,MIC90為2.92 μg/mL;甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹的MIC50雖然不高,分別為3.60、2.25、0.4 μg/mL,但MIC90卻很高,分別為117.50、29.76、10.23 μg/mL。磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶對分離菌株的MIC50和MIC90均較高。

表2 60株病原菌對抗菌藥物的感受性分布

表3 60株病原菌對磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的感受性分布

從抗菌藥物MIC分布情況來看,每種藥物都有相對集中的MIC分布。恩諾沙星的MIC主要分布在0.008～0.5 μg/mL之間,硫酸新霉素的MIC主要分布在0.25～4 μg/mL之間,甲砜霉素的MIC主要分布在1～4 μg/mL之間,氟苯尼考的MIC主要分布在1～2 μg/mL之間,鹽酸多西環素的MIC主要分布在0.06～4 μg/mL之間,氟甲喹的MIC主要分布在0.125～4 μg/mL之間,磺胺間甲氧嘧啶的MIC主要分布在128～1 024 μg/mL之間,磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的MIC主要分布在76/4～608/32 μg/mL之間。

2.3 不同種類氣單胞菌對水產用抗菌藥物的感受性

2.3.1 嗜水氣單胞菌對水產用抗菌藥物的感受性

32株嗜水氣單胞菌對抗菌藥物感受性分布情況見表4、表5。恩諾沙星、硫酸新霉素、氟甲喹、鹽酸多西環素對分離菌株的MIC50較低,分別為0.08、0.76、0.20、0.23 μg/mL;恩諾沙星和鹽酸多西環素的MIC90較低,分別為0.65、0.87 μg/mL。磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶對分離菌株的MIC50和MIC90均較高。

表4 嗜水氣單胞菌對抗菌藥物的感受性分布

表5 嗜水氣單胞菌對磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的感受性分布

2.3.2 溫和氣單胞菌對水產用抗菌藥物的感受性 18株溫和氣單胞菌對抗菌藥物感受性分布情況見表6、表7。恩諾沙星、氟甲喹、鹽酸多西環素對分離菌株的MIC50較低,分別為0.15、0.54、0.18 μg/mL,鹽酸多西環素的MIC90最低,為2.35 μg/mL。恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹的MIC50雖然不高,但MIC90卻很高,分別為6.23、11.39、314.01、55.33、11.00 μg/mL。磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶對分離菌株的MIC50和MIC90均較高。

表6 溫和氣單胞菌對抗菌藥物的感受性分布

表7 溫和氣單胞菌對磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的感受性分布

2.3.3 維氏氣單胞菌對水產用抗菌藥物的感受性 8株維氏氣單胞菌對抗菌藥物的感受性分布情況見表8、表9。恩諾沙星、鹽酸多西環素對分離菌株的MIC50較低,分別為0.19、0.49 μg/mL,恩諾沙星、鹽酸多西環素的MIC90較低,分別為1.3、3.68 μg/mL。甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹的MIC50雖然不高,但MIC90卻很高,分別為41.31、15.02、22.63 μg/mL。磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶對分離菌株的MIC50和MIC90均較高。

表8 維氏氣單胞菌對抗菌藥物的感受性分布

表9 維氏氣單胞菌對磺胺甲噁唑/甲氧芐啶的感受性分布

2.3.4 豚鼠氣單胞菌對水產用抗菌藥物的感受性 豚鼠氣單胞菌由于分離數量較少,不進行MIC50和MIC90統計分析,其藥敏試驗結果見表10。結果顯示除恩諾沙星的MIC較低外,豚鼠氣單胞菌對其它7種藥物均呈現不同程度的耐受。

表10 豚鼠氣單胞菌對抗菌藥物感受性

2.4 不同種類氣單胞菌對水產用抗菌藥物感受性比較

嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞據、維氏氣單胞菌對抗菌藥物感受性結果進行Kruskal-Wallis 檢驗分析,結果如表11所示。3種氣單胞菌對硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟甲喹、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶感受性存在差異,經Bonferroni法校正顯著性水平的事后兩兩比較發現(表12),嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌與維氏氣單胞菌對硫酸新霉素、氟苯尼考感受性存在差異,嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌對甲砜霉素感受性存在差異,3種氣單胞菌對氟甲喹和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶感受性經Bonferroni法校正顯著性水平的事后兩兩比較后,差異不顯著。

表11 3種氣單胞菌之間對抗拒藥物感受性Kruskal-Wallis檢驗

表12 3種氣單胞菌對抗菌藥物感受性兩兩比較結果

3 討論

氣單胞菌屬細菌是大宗淡水魚類細菌性敗血癥的主要病原,其中嗜水氣單胞菌為最為常見的致病菌,2022年分離菌株中,嗜水氣單胞菌占總數的53.34%,吳亞鋒等[5]2017—2018年從江蘇分離氣單胞菌1 364株,分離菌株中以嗜水氣單胞菌最多,占67.23%,與本研究分離情況較為相似。而王一娟[6],張德鋒等[7],鄧玉婷等[8]從魚類分離獲得的病原菌以維氏氣單胞菌為主,說明不同地區,氣單胞菌的組成存在一定差異。

氣單胞菌對抗菌藥物的感受性總體情況表明,恩諾沙星、硫酸新霉素、鹽酸多西環素對分離菌株的抑菌效果較好,而磺胺類的兩種藥物、甲砜霉素的抑菌效果較差,與梁倩蓉等[9]2019年在浙江地區淡水養殖品種中分離的病原菌對抗菌藥物感受性結果較為相似。同為酰氨醇類藥物,氟苯尼考相對于甲砜霉素則呈現出不同程度的抑菌效果,這可能與氟苯尼考的分子結構有關,從而表現出對甲砜霉素耐藥細菌仍敏感[10]。比較不同種屬的氣單胞菌對抗菌藥物感受性,結果顯示不同種屬氣單胞菌對抗菌藥物感受性存在一定差異,與吳亞鋒等[5]、鄧玉婷等[8]報道一致。

在CLSI中,敏感是指使用常規劑量時的平均血藥濃度超過MIC 4倍以上,用常規劑量通常有效,耐藥是指藥物對細菌的MIC高于應用常規劑量時的血藥濃度,應用常規劑量治療通常無效。由于藥物在魚和人體內的藥代動力學數據不同,而判斷細菌是否敏感必須考慮藥物在體內的動力學特性,因此使用醫學上敏感、耐藥標準進行結果判定是不合理的[11]。故本文未采用醫學上的標準進行結果判定。通過研究發現,同一種藥物在不同的水產動物體內,其藥代動力學也不完全相同,張國棟等[12]研究發現恩諾沙星乳在異育銀鯽和斑點叉尾鮰體內的峰濃度分別為 4.66 μg/mL 和 3.95 μg/mL,朱曉漫等[13]研究發現恩諾沙星在羅非魚血漿峰濃度為 4.38 mg/L。因此在藥物使用中需根據養殖品種,結合藥敏試驗結果和藥代動力學相關數據確定藥物使用劑量和周期,避免耐藥菌的產生并保障水產品質量安全。