3D打印的PU支架復(fù)合CA以及PRF促進(jìn)軟骨再生的研究

楊夢琪 全雅琦 曾子瑜 王忠山

長期以來,外耳廓缺損的主要臨床修復(fù)方法包括外科整形手術(shù)和贗復(fù)體修復(fù)。 外科手術(shù)主要是切取患者自體肋軟骨后進(jìn)行雕刻后移植,不僅造成患者供區(qū)損傷,而且臨床技術(shù)敏感性高,難以推廣。贗復(fù)體修復(fù)則存在材料老化變色、固位困難等問題[1]。

近年來,組織工程耳廓軟骨成為替代傳統(tǒng)耳廓重建方法的選擇。如Cao等[2]和Jia等[3]應(yīng)用聚乳酸、聚羥基乙酸、聚己內(nèi)酯等可完全降解的生物材料制成人耳廓支架,將支架與軟骨細(xì)胞復(fù)合后進(jìn)行體外研究和動物實(shí)驗,最終構(gòu)建出人耳廓形態(tài)軟骨。但是過量的酸性降解產(chǎn)物蓄積后易引起局部炎癥反應(yīng),而且支架不規(guī)律降解后難以長期精確維持耳廓軟骨形態(tài)。李生杰等[4]曾選擇生物相容性好、不可降解的醫(yī)用聚氨酯(polyurethane,PU),通過熔融沉積技術(shù)快速成型出一種外形逼真、機(jī)械強(qiáng)度可調(diào)的皮下植入式人耳廓支架,在一定程度上解決了支架難以長期維持耳廓精確形貌的難題,但是后續(xù)實(shí)驗證實(shí)軟骨細(xì)胞在單純的PU材料表面粘附性差、死亡率高,且形成的軟骨組織與材料結(jié)合性差,易于撕脫[5]。

因此,本研究擬利用軟骨細(xì)胞聚集體(chondrocyte aggregates,CA)結(jié)合富血小板纖維蛋白(platelet rich fibrin,PRF),改善PU支架表面微環(huán)境,提高軟骨細(xì)胞接種后的成活率、增殖速率以及維持軟骨表型。其中CA技術(shù)是將軟骨細(xì)胞在富含抗壞血酸的高糖培養(yǎng)液中進(jìn)行復(fù)層誘導(dǎo),在體外形成一種由大量細(xì)胞外基質(zhì)嚴(yán)密包裹軟骨細(xì)胞的膜狀結(jié)構(gòu)。在軟骨細(xì)胞接種至生物材料表面時,CA技術(shù)可以有效地保持交聯(lián)的細(xì)胞連接狀態(tài)和成軟骨微環(huán)境, 從而減少移植時的細(xì)胞流失,提高細(xì)胞存活率[6]。PRF凝膠是一種具有三維纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的富含血小板的全血提取物。纖維蛋白附著于PU支架后,可提高細(xì)胞在材料表面的黏附能力,其降解吸收后的產(chǎn)物又可對CA起到營養(yǎng)和支持的作用[7]。PRF中富含的血小板可緩釋多種生長因子,如血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等,約為全血的3～8 倍之多,根據(jù)文獻(xiàn)報道,PRF對軟骨細(xì)胞的生長、遷移、軟骨基質(zhì)形成均有不同程度的促進(jìn)作用[8]。

該研究擬利用3D打印的PU多孔支架長期維持重建軟骨形態(tài),通過CA和PRF技術(shù)改善細(xì)胞接種至PU孔隙時的成軟骨微環(huán)境,從而改善PU多孔支架的成軟骨效果,為今后特定形態(tài)的軟骨缺損再生提供一種新型的組織工程解決方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

實(shí)驗在獲得空軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號: 2022kq012),于空軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院動物中心完成。1 月齡雄性新西蘭大白兔3只,體重1.2～1.4 kg,用于獲取原代兔耳廓軟骨細(xì)胞;6 月齡健康新西蘭大白兔10 只,雌雄不限,體重2.4～3.2 kg,用于由耳中央動脈提取PRF;2.5 月齡雄性免疫缺陷鼠16 只(北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司),用于PU/CA/PRF復(fù)合體異位移植實(shí)驗。

1.2 實(shí)驗試劑及儀器

PU(Alberdingk Boley,德國);3D 打印機(jī)(北京殷華);H-DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS(Hyclone, 美國);CCK-8試劑盒(江蘇碧云天);0.25%胰蛋白酶(北京雷根);進(jìn)口分裝 ELISA 試劑盒(R&D 公司,美國);抗兔COL-II抗體(Santa Cruz Biotechnology,美國); DAB標(biāo)記II抗(北京中杉金橋);細(xì)胞孵箱(Thermo SCIENTIFIC,美國);反轉(zhuǎn)錄PCR儀、實(shí)時定量分析儀、實(shí)時定量分析軟件(Bio-Rad 公司,美國);Synergy HT酶標(biāo)儀(BioTek,美國);超凈工作臺(蘇州AIRTECH);掃描電鏡(S-4800;Hitachi 公司,日本)。

1.3 PU支架的制備

利用計算機(jī)輔助設(shè)計(computer aided design,CAD)軟件設(shè)計PU支架試件,材料設(shè)置為15 mm×15 mm×5 mm的長方體,孔徑為400 μm, 孔隙率控制在60%。將設(shè)計對象轉(zhuǎn)換成STL格式,輸入3D打印機(jī)。調(diào)整3D打印機(jī)相關(guān)屬性參數(shù)(噴頭直徑400 μm,掃描速度30 mm/s,成形室溫度為50 ℃)進(jìn)行打印。本實(shí)驗采用熔融沉積技術(shù)(fused deposition modeling,FDM) 共打印PU試件50 枚,γ射線消毒后備用[4]。隨機(jī)抽取3 枚試件,干燥、噴金后,掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)下觀察表面超微結(jié)構(gòu)。

1.4 新西蘭大白兔耳廓軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)

無菌切取1月齡新西蘭大白兔雙側(cè)耳廓軟骨,剪成1 mm3的組織塊,用含雙抗PBS沖洗3 遍,加入約5 倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶,37 ℃恒溫水浴振蕩器內(nèi)消化5 h,1 500 r/min離心5 min,棄上清, PBS沖洗2 遍。加入H-DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS,青、鏈霉素各100 U/mL)重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL后接種于10 cm dish培養(yǎng)。每隔48 h換液,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至90%匯合,標(biāo)記為原代,常規(guī)胰酶消化傳代。

1.5 軟骨細(xì)胞聚集體的制備以及鑒定

將第3代軟骨細(xì)胞以5×104個/孔的密度接種至6 孔板,生長至90%左右匯合時,加入CA誘導(dǎo)液(含50 μg/mL抗壞血酸和15%FBS的H-DMEM培養(yǎng)液),連續(xù)培養(yǎng)10 d,待生長至邊緣卷曲,肉眼觀察成為白色半透明膜時,即為成熟的CA。用鈍頭鑷子將CA細(xì)心剝離后,石蠟包埋,HE染色。分別提取CA、P3代軟骨細(xì)胞總RNA,q-PCR檢測Aggrecan、Collagen II、Sox9基因的相對表達(dá)量。由GenBank查找引物設(shè)計與合成的基因序列,使用軟件Primer Express 2.0進(jìn)行引物設(shè)計,引物序列由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.6 PRF制備

用10 mL注射器于6 月齡新西蘭大白兔耳中央動脈抽取10 mL血液,迅速轉(zhuǎn)移至不加抗凝劑的10 mL玻璃離心管,以3 000 r/min的速度離心12 min;4 ℃靜置5 min,可見管中的血液出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象,上層為少量透明的缺乏血小板的血漿層;中間層為淡黃色半透明的PRF凝膠;下層為體積約占40%～50%的紅細(xì)胞層。棄去血漿層,用眼科剪將纖維蛋白凝塊底部的紅血細(xì)胞層分離,此時注意保留凝膠以下約1 mm厚度的紅細(xì)胞層,白細(xì)胞和血小板在此交界區(qū)域的濃度較高[7]。

1.7 SEM觀察PRF以及連續(xù)7 d生長因子的緩釋

1.8 PRF對軟骨細(xì)胞增殖和分化的影響

將10 mL血液制備的一整張PRF膜沿其長軸縱向均分,大小分別為1/2 PRF、1/4 PRF、1/8 PRF。將P3代軟骨細(xì)胞以3×104/孔的密度分別接種于24 孔培養(yǎng)板,每孔滴加2 mL含10% FBS的完全培養(yǎng)液,孵育12 h(細(xì)胞貼壁完成)后,向?qū)嶒灲M中分別加入1/8、 1/4、 1/2 PRF,對照組不加PRF,各組分別設(shè)置4重復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng),每隔3 d換液。采用細(xì)胞計數(shù)法檢測各組加入PRF第1、3、5天時細(xì)胞增殖數(shù)量。具體步驟為:以組為單位,去除培養(yǎng)液及 PRF,常規(guī)0.25%胰酶消化,將收集的細(xì)胞重懸于3 mL培養(yǎng)液中,混勻;取20 μL,采用紅血球計數(shù)板行細(xì)胞計數(shù),計算細(xì)胞總數(shù);以組為單位,每吸取細(xì)胞懸液100 μL轉(zhuǎn)移至96 孔培養(yǎng)板1 孔,每孔滴加10 μL CCK-8試劑,標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中孵育2 h,采用多功能酶標(biāo)儀測定波長為450 nm處A值,計算平均數(shù)(n=5),繪制生長曲線。

將P3代軟骨細(xì)胞以3×104/孔的密度分別接種于6 孔培養(yǎng)板,每孔滴加2 mL含10%FBS的完全培養(yǎng)液,孵育12 h(細(xì)胞貼壁完成)后,向?qū)嶒灲M中1/2 PRF,對照組不加PRF,各組分別設(shè)置4重復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后,提取RNA,Real-time PCR檢測Aggrecan、Collagen II、Sox9基因表達(dá)。

1.9 裸鼠皮下支架移植

實(shí)驗組:用無菌吸管將誘導(dǎo)成熟的CA反復(fù)吹打成小于0.2 mm3大小碎片;將PRF用眼科剪剪成小于0.2 mm3的碎屑,1∶1混合均勻后形成可注射的CA/PRF混合物,將其注滿PU內(nèi)部孔隙與表面,然后將CA/PRF/PU復(fù)合體植入裸鼠皮下(n=10)。對照組:將5 個10 cm dish長滿的P3代軟骨細(xì)胞用0.25%胰酶消化,等量含10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基中和胰酶,1 200 r/min離心,棄上清,用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞的密度至5.0×107/mL,無菌環(huán)境下將軟骨細(xì)胞懸液滴滿PU支架內(nèi)部孔隙和表面,孵箱內(nèi)靜置2 h,使細(xì)胞初步黏附于支架,然后裸鼠皮下移植(n=10)。異位移植時將裸鼠以氯胺酮麻醉,在裸鼠背部兩側(cè)做約2 cm縱行切口,潛行分離后,每只裸鼠背部皮下分別植入兩組移植物。移植物距離切口至少2 cm,嚴(yán)密縫合手術(shù)切口。

8 周后解剖分離標(biāo)本,甲基丙烯酸甲酯包埋后進(jìn)行硬組織切片,分別行甲苯胺藍(lán)、番紅-O、Collagen II免疫組化染色,觀察新生軟骨的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。Collagen II免疫組化染色結(jié)果觀察使用Olympus正置顯微鏡,圖像采集使用PRECiVTM軟件,染色結(jié)果定量分析使用Image J 1.53r軟件。采用相同參數(shù)獲取免疫組化圖像,將圖像用Image J軟件轉(zhuǎn)換為8 位圖像,測量Collagen II染色強(qiáng)度同時測量并減去背景參數(shù),統(tǒng)計數(shù)值來自不同圖像的平均值(n=3)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 PU支架形態(tài)

3D打印的PU復(fù)合支架為15 mm×15 mm×5 mm的長方體試件, 呈淡黃色, 表面較光滑, 質(zhì)均勻,支架成品的尺寸與3D打印設(shè)計的幾何模型尺寸基本一致。掃描電鏡下可見支架表面光滑,內(nèi)部布滿豐富的微孔,微孔直徑分布在(420±72) μm之間,孔隙之間存在約70%的交通率(圖1)。

圖1 PU支架SEM觀察Fig 1 Observation of PU scaffold by SEM

2.2 CA形態(tài)及鑒定

倒置顯微鏡觀察顯示:第3天時細(xì)胞已長滿培養(yǎng)皿底部(圖2A);此后開始大量形成細(xì)胞外基質(zhì),隨著基質(zhì)成分的增加,細(xì)胞排列更為緊密,10 d后CA成熟,表面均勻、平整、無破潰,邊緣卷曲;可用鈍頭鑷子將其從邊緣完整揭起,分離后的CA在培養(yǎng)液中逐漸攣縮成不規(guī)則形態(tài)(圖2B)。HE切片結(jié)果顯示:CA包含較多層細(xì)胞(3～6 層),細(xì)胞連接緊密,且被分泌的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)嚴(yán)密包裹(圖2C)。免疫組化染色顯示:CA強(qiáng)陽性表達(dá)Collagen II,該蛋白是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要組分。qPCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):與P3代軟骨細(xì)胞相比, 誘導(dǎo)為細(xì)胞聚集體后以下基因呈現(xiàn)高水平表達(dá)(圖3):Aggrecan基因相對表達(dá)量約為P3代軟骨細(xì)胞的3.28 倍,Collagen II基因約為5.57 倍,Sox9基因約為3.18 倍,以上3 種基因表達(dá)量與單純的P3代軟骨細(xì)胞相比均明顯上升(P<0.05)。

圖2 CA的觀察結(jié)果Fig 2 Observation of CA

圖3 兩組標(biāo)本的軟骨相關(guān)基因表達(dá)情況Fig 3 Expression of cartilage-related genes in the 2 groups of specimens

2.3 PRF的形態(tài)

如圖4A,采用一次性離心法制備PRF纖維蛋白凝膠。大體觀察發(fā)現(xiàn):PRF膜中上部結(jié)構(gòu)簡單,呈黃色;下部呈紅色。SEM觀察結(jié)果顯示,PRF的支架結(jié)構(gòu)主要包含粗大的纖維蛋白束和一些直徑較小的纖維蛋白束夾雜其中,形成一種三維立體結(jié)構(gòu)(圖4B)。PRF的上部黃色區(qū)域表現(xiàn)出不含細(xì)胞的簡潔的外觀,而PRF的下部紅色區(qū)域含有密集的血小板,一些紅細(xì)胞和白細(xì)胞嵌入在由纖維蛋白構(gòu)成的三維的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)之中(圖4B)。

2.4 ELISA法檢測 PRF中主要生長因子的緩釋特點(diǎn)

采用酶聯(lián)免疫吸附法測定一張完整的PRF膜在7 d內(nèi)5 種主要的生長因子的緩釋情況。結(jié)果表明,各種生長因子的釋放特點(diǎn)呈現(xiàn)時間依賴效應(yīng),隨時間延長,其釋放量呈現(xiàn)遞減的規(guī)律。此外,生長因子的釋放量呈現(xiàn)前3天突釋,之后釋放量遞減的特點(diǎn)(表1)。

表1 1 張完整PRF膜中7 d內(nèi)釋放的5 種生長因子量Tab 1 Amount of the growth factors released from a intact PRF film in 7 days

2.5 PRF對軟骨細(xì)胞增殖、分化的影響

采用細(xì)胞計數(shù)法以及CCK8法測定不同濃度的PRF 對軟骨細(xì)胞增殖的影響(圖5A～B),結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,1/8、 1/4、 1/2 PRF組均不同程度地促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖(P<0.05)。且PRF在不同劑量之間的影響無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

圖5 PRF對軟骨細(xì)胞增殖以及基因表達(dá)的影響Fig 5 The effects of PRF on chondrocyte proliferation and gene expression

通過q-PCR分析發(fā)現(xiàn):與P3代軟骨細(xì)胞相比, 六孔板內(nèi)每孔軟骨細(xì)胞與1/2 PRF共培養(yǎng)后表現(xiàn)出以下基因的高水平表達(dá)(圖5C):Aggrecan基因相對表達(dá)量約為P3代軟骨細(xì)胞的2.18 倍,Col-II基因約為6.07 倍,Sox9基因約為3.39 倍(P<0.05),而且Col-II基因的相對表達(dá)量上調(diào)最明顯。

2.6 硬組織切片及染色觀察

兩組標(biāo)本在設(shè)定硬組織切片厚度為20～100 μm后進(jìn)行切片染色觀察。番紅-O染色結(jié)果顯示軟骨細(xì)胞基質(zhì)呈紅色(圖6A、B),甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示新生軟骨細(xì)胞基質(zhì)呈紫紅色(圖6C、D)。PU/Cho組新生軟骨組織呈島狀,散在分布于PU支架周圍,軟骨陷窩結(jié)構(gòu)較少見,取而代之形成大量的結(jié)締組織(圖6A、C、E)。PU/CA/PRF組可見大量新生軟骨組織呈團(tuán)狀包裹、鑲嵌于PU支架周圍,軟骨陷窩結(jié)構(gòu)明顯增多,形成的軟骨樣組織嵌入支架內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)(圖6B、D、F)。實(shí)驗組免疫組化結(jié)果顯示:II型膠原蛋白的染色呈陽性,膠原蛋白纖維廣泛分布在軟骨基質(zhì)中(圖6F)。 II型膠原免疫組化染色定量結(jié)果顯示:PU/CA/PRF組II型膠原蛋白的染色強(qiáng)度約為PU/Cho組的1.44 倍,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖7)。

圖6 兩組標(biāo)本的硬組織切片染色結(jié)果Fig 6 Staining results of hard tissue sections of the 2 groups of specimens

圖7 兩組標(biāo)本II型膠原表達(dá)Fig 7 The expression of type II collagen the 2 groups of specimens

3 討 論

國內(nèi)外多個課題組曾使用生物安全性好、不可降解的PU材料,用于制作軟骨再生支架。然而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),單純的PU支架與軟骨細(xì)胞結(jié)合能力差、細(xì)胞粘附困難、死亡率高,因此形成的新生軟骨組織數(shù)量少且容易撕脫[5-6]。本研究應(yīng)用熔融沉積技術(shù)(FDM)快速成型為特定形態(tài)的PU多孔支架,多孔形態(tài)特征增加了支架表面積,為軟骨細(xì)胞向支架內(nèi)部生長打開通道,形成鑲嵌結(jié)構(gòu),從而增加兩者結(jié)合的穩(wěn)固性。同時,為了增加軟骨細(xì)胞接種后的存活率、增殖速度、以及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌,本研究嘗試運(yùn)用軟骨細(xì)胞聚集體(CA)技術(shù)結(jié)合富血小板纖維蛋白(PRF)以改善軟骨細(xì)胞生長微環(huán)境,促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖以及軟骨細(xì)胞表型的維持,以改善軟骨細(xì)胞在PU支架內(nèi)新生軟骨的質(zhì)量。

對于構(gòu)建不規(guī)則形狀的軟骨,3D打印技術(shù)可以生產(chǎn)具有三維復(fù)雜內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)和不同層不同結(jié)構(gòu)的軟骨支架,為細(xì)胞提供附著、增殖和營養(yǎng)運(yùn)輸?shù)膱鏊Ｈ廴诔练e方法涉及的硬件和材料容易獲得,成本相對較低,是一種經(jīng)濟(jì)可行的個性化定制植入物的技術(shù)。并且其對設(shè)計參數(shù)的控制較靈活,對于材料、孔隙率以及幾何形狀都可改進(jìn),靈活調(diào)整細(xì)胞粘附、滲透以及生長[4,9]。本研究中所設(shè)計的PU支架具有出色的形狀記憶功能,以及接近軟骨的彈性和拉伸強(qiáng)度,從而能長期維持人外耳廓精確形態(tài),維持美觀和功能[4,10]。該支架孔隙率為60%,具有更大的表面積,為新生軟骨的生長提供空間。微孔直徑分布在(420±72) μm之間,前期研究結(jié)果證實(shí)300～1 200 μm之間的孔徑有利于細(xì)胞和纖維蛋白的快速附著和生長[11]。

軟骨細(xì)胞移植前的一個重要挑戰(zhàn),是對軟骨細(xì)胞的質(zhì)量進(jìn)行控制。單純擴(kuò)增的離散軟骨細(xì)胞,喪失了正常的成軟骨細(xì)胞微環(huán)境,接種于PU支架上存活率低,增殖速度慢,而且極易發(fā)生軟骨細(xì)胞“去分化”(chondrocyte dedifferentiation)現(xiàn)象。即已經(jīng)分化成熟的軟骨細(xì)胞在體外環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增后,失去自己的成熟功能表型,轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N纖維軟骨細(xì)胞[12]。雖然從離體初始細(xì)胞失去功能表型,到仍可在適宜條件刺激下(如三維培養(yǎng))恢復(fù)功能;但是當(dāng)去分化持續(xù)的時間過長,軟骨細(xì)胞將沒有這種恢復(fù)的潛能[11]。本研究采用的CA技術(shù)能夠保證在體外細(xì)胞培養(yǎng)時形成基質(zhì)嚴(yán)密包裹軟骨細(xì)胞的多層細(xì)胞的膜狀結(jié)構(gòu),類似于“三維培養(yǎng)”,從而有利于軟骨細(xì)胞表型的維持[13]。本研究結(jié)果證實(shí):軟骨細(xì)胞聚集體含有3～6 層細(xì)胞結(jié)構(gòu),細(xì)胞間緊密有序排列。同時,與單個的軟骨細(xì)胞相比,在CA中出現(xiàn)了軟骨細(xì)胞表型相關(guān)基因的高水平表達(dá),如Aggrecan、Col-II以及Sox9基因均出現(xiàn)不同程度的表達(dá)升高(P<0.05)。不僅如此,CA技術(shù)為移植后軟骨細(xì)胞的生長提供初步的適宜微環(huán)境,有效地保護(hù)和促進(jìn)軟骨細(xì)胞間物質(zhì)交換,減少移植過程的細(xì)胞流失,提高細(xì)胞存活率和增殖速率。

文獻(xiàn)報道,PRF對軟骨細(xì)胞的生長、遷移、軟骨基質(zhì)形成均有不同程度的促進(jìn)作用[7]。PRF可緩釋多種生長因子,約為全血的3～8 倍之多,本研究中ELISA實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)論。其中血小板衍生生長因子AB,表皮生長因子等,已被證明通過相互作用促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。本研究也證實(shí)了不同濃度的PRF均有促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖的作用,但不同濃度組之間未發(fā)現(xiàn)明顯統(tǒng)計學(xué)差異,此結(jié)論與前期研究結(jié)果一致。PRF中富含的轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、血管內(nèi)皮生長因子則在軟骨分化和軟骨組織成熟中發(fā)揮重要的作用,IGF-1與TGF-β發(fā)揮協(xié)同作用后,可實(shí)現(xiàn)其累加效應(yīng)[14]。同時,PRF對于軟骨細(xì)胞的表型基因Aggrecan、Col-II以及Sox9,同樣具有不同程度的促進(jìn)作用(P<0.05),對Col-II基因表達(dá)的促進(jìn)作用最明顯,揭示了PRF加入后也有利于軟骨細(xì)胞表型的維持。值得一提的是,PRF膜可以長期緩慢釋放各種生長因子持續(xù)作用于軟骨細(xì)胞,因而發(fā)揮更加穩(wěn)定持久的促進(jìn)作用[15]。

動物實(shí)驗再次證實(shí)了在3D打印的PU支架上,相比于單純的軟骨細(xì)胞,CA與PRF復(fù)合后顯示了更為出色的促軟骨再生的功能。3 種不同的染色方法顯示:PU與CA、PRF復(fù)合組可見大量成熟的軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)形成,與支架緊密結(jié)合,II型膠原表達(dá)處于較高水平。而單純PU與軟骨細(xì)胞復(fù)合組形成的軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)較少,更多可見大量的纖維結(jié)締組織形成。其原因可能是,CA與PRF提高了種子細(xì)胞接種支架的成活率,以及粘附、增殖速率,能夠長期維持成熟的軟骨細(xì)胞的表型,從而為PU與軟骨細(xì)胞的生長結(jié)合提供了新的可能。

4 結(jié) 論

本研究以3D打印的PU支架、結(jié)合CA以及PRF移植于裸鼠皮下成功形成了長期維持特定形貌的新生軟骨組織。CA以及PRF的聯(lián)合應(yīng)用改善了PU支架內(nèi)成軟骨的微環(huán)境,有利于軟骨細(xì)胞的增殖和軟骨表型維持,為生物材料與種子細(xì)胞的結(jié)合以及構(gòu)建具有精確三維形態(tài)的人外耳廓軟骨提供了新的解決方案。