CircRNA_TRMP7靶向調控NLRP3炎癥小體在小鼠Ⅱ型糖尿病牙周組織炎癥中的作用機制

沈想 王陳飛 張敏 梅幼敏

II型糖尿病是牙周病的主要誘發因素之一,而牙周病是成年人失牙的主要原因,也是諸多全身性疾病的重要危險因素,如何預防T2DM患者的牙周病的發生成為近年來關注的熱點[1-3]。環狀RNA(CircRNA)是一種非編碼RNA,在糖尿病及其并發癥的病理過程中起著重要的調控作用,并與牙周組織炎癥密切相關[4-6]。NLRP3炎癥小體是Nod 樣受體家族中一類含有 pyrin 結構域的蛋白3功能復合體,已被發現在牙周組織炎癥的發生中扮演著重要角色[7],但相關機制仍不明確,因此本研究初步探討在T2DM環境下,BMDMs中circRNA_TRMP7對NLRP3炎癥小體激活的調控作用,并檢測分析相關炎癥因子的表達,為T2DM牙周組織炎癥的病因學研究及精準預防提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

人全血單個核細胞分離液(天津灝洋);DMEM高糖培養基(GIBCO公司,美國);胎牛血清(HYCLONE公司,美國);Murine M-CSF(Peprotech,美國);RNA提取試劑盒(上海生工);PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM(大連TaKara公司);兔源NLRP3、Caspase-1 p20多克隆抗體(Abcam,美國);IL-1β、IL-18-Elisa試劑盒(Novus,美國);熒光分光光度儀(F-7000,日立,日本);基因PCR擴增儀(Mastercycle X50,Eppendorf公司,德國);實時熒光定量PCR系統(7300 Realtime PCR system,Applied Biosystems公司,美國);SDS-PAGE電泳儀(1645050,Bio-Rad公司,美國)。

1.2 人血PMBCs提取和全轉錄組測序

本研究選取2020 年1 月～2022 年1 月南通大學附屬醫院內分泌科16 例T2DM患者(年齡35～62 歲)作為實驗組(根據《中國2型糖尿病防治指南》中的T2DM 診斷標準),選取南通大學附屬醫院體檢中心21 例健康人作為對照組(年齡35～65 歲)。排除標準:(1)牙周病(根據2018 年牙周病國際新分類)及影響牙周病的其他系統性疾病(如艾滋病、風濕及腫瘤等);(2)吸煙史;(3)3 個月內有全身性抗菌藥物、類固醇及非甾體類抗炎藥物應用史。研究對象對所有治療過程知情同意,并簽署知情同意書。本研究獲得南通大學附屬醫院倫理委員會批準(批號:2021-L088)。

提取外周血至分離液液面上,離心,吸取單個核細胞層與清洗液混勻,離心棄上清收集PBMCs。PBMCs去除核糖體RNA,片段化處理、建庫、測序獲得RNA序列信息。利用kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)數據庫對差異的circRNA進行Pathway分析和超幾何分布檢驗,尋找與差異circRNA可能相關的信號通路。

1.3 T2DM小鼠建模

隨機選取4 周齡C57BL/6小鼠10只,對照組是非糖尿病的正常小鼠,以高脂飲食喂養4 周,STZ溶液(80 mg/kg)腹腔注射,高脂飲食喂養2 周,測血糖;成功標準:隨機血糖值>16.7 mmol/L、多飲多食多尿,體重減輕。

1.4 BMDMs的極化誘導和siRNA干擾

取6～8 周C57BL/6小鼠脛骨和股骨骨髓,裂紅細胞重懸,高糖培養液培養(含murine M-CSF)5 d,收集BMDMs。更換培養液(含50 ng/mL的LPS和10 ng/mL的IFN-γ)誘導24 h,收集M1型巨噬細胞。雙鏈小分子RNA(siRNA,銳博生物科技有限公司)轉染M1型巨噬細胞,抑制circRNA_TRMP7的表達。

1.5 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)

提取細胞總RNA,測定濃度(純度1.6～1.8),RNA逆轉錄,實時定量PCR擴增cDNA,2-ΔΔCT統計分析各組circRNA的表達(β-actin內參)。

1.6 免疫組化實驗

提取小鼠下頜骨脫鈣制片、封閉、一抗孵育過夜、二抗孵育、顯色封片。每張切片隨機選擇不重疊的5 個視野(×40),Image J軟件分析陽性著色區域的面積百分比,每組5 張不同切片,進行組間比較。

1.7 Western blot和ELISA檢測

SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,轉膜,封閉、洗滌,一抗孵育過夜,二抗孵育1 h,洗膜曝光成像。應用ELISA試劑盒和酶標儀(設定540 nm校正波長)檢測各組細胞上清中的IL-18和IL-1β的濃度水平。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 CircRNA在人外周血單個核細胞中的表達

全轉錄組測序發現,較對照組實驗組有38 個下調和36 個上調的circRNA(圖1)。選取上調前10的circRNA進行RT-PCR驗證,結果顯示circRNA_2562(circRNA_TRMP7)差異表達最為明顯,在放線菌素D作用下結構也較為穩定(圖2)。通過KEGG分析發現circRNA_TRMP7可能參與NOD樣受體相關的信號通路。

圖1 CircRNA在PBMSs的差異性表達及生物信息學分析Fig 1 The differential expression of circRNA PBMSs and bioinformatic analysis

圖2 結合全轉錄組測序篩選目標circRNAFig 2 Screening the targeted circRNA based on transcriptome sequencing

2.2 NLRP3炎癥小體相關指標在小鼠牙周組織中的表達

免疫組化結果表明與對照組小鼠相比,NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白在T2DM小鼠的牙周組織中高表達(圖3A～E),兩組間具有統計學差異(P<0.05)(圖3C～F)。

圖3 小鼠牙周組織中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18免疫組化染色結果Fig 3 Immunohistochemical staining results of NLRP3 and Caspase-1 in the periodontal tissue of mice

2.3 巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的表達

RT-PCR實驗發現,與對照組小鼠相比在T2DM小鼠M1型巨噬細胞中Caspase-1、NLRP3的表達較高 (圖4B～C);Elisa實驗證實,T2DM小鼠的M1型巨噬細胞上清中的IL-1β和IL-18含量較多(P<0.05)。提示T2DM可能促進M1型巨噬細胞中的NLRP3炎癥小體的激活(圖4D～E)。

圖4 Caspase-1、NLRP3在小鼠M1型巨噬細胞中的表達以及IL-1β、IL-18在細胞上清中的含量Fig 4 Expression of Caspase-1 and NLRP3 in M1 macrophages and the content of IL-1β and IL-18 in cell supernatant of the mice

2.4 干預circRNA_TRMP7的表達對NLRP3炎癥小體激活的影響

應用siRNA-circRNA_TRMP7轉染T2DM小鼠來源的M1型巨噬細胞,抑制circRNA_TRMP7的表達,通過Western-blot和Elisa實驗證實siRNA可以減弱M1型巨噬細胞中Caspase-1和NLRP3的表達,降低細胞上清中IL-1β和IL-18的含量(P<0.05)(圖5)。

3 討 論

牙周病的發生發展嚴重影響患者的生活質量,同時也影響血糖控制,還可能誘發心血管疾病、腎病等其他并發癥。然而,因為T2DM患者牙周病變的發生較為隱蔽,在臨床上難以把握早期預防的時機[8-9]。2011年首次提出了“精準醫學”的概念,作為其重要分支之一,口腔精準醫學要求對口腔疾病發生的分子機制做深入研究,以實現對口腔疾病的“精準預防”[10]。而口腔精準預防的核心目標之一即是對“口腔亞健康”狀態的檢測[11-12]。因此,在T2DM環境下的牙周組織中探尋炎癥的發生機制具有重要意義。巨噬細胞是牙周組織中的一種免疫細胞,T2DM會誘發巨噬細胞的激活,促進炎癥因子的分泌,在牙周炎癥發生的初始階段至關重要[13-14]。由此提示巨噬細胞可能是精準預防T2DM牙周組織炎癥發生的重要細胞之一。

circRNA是一種單鏈內源性的長鏈非編碼RNA,具有共價閉環結構。大量研究表明,circRNA在不同疾病中可呈現特異性表達,并具有重要的調節功能。

有研究報道,在體外模擬牙周炎的細胞實驗中,circRNAMAP3K11會促進牙周膜干細胞增殖并抑制其凋亡;circRNA在牙周組織的再生修復和炎癥反應中起著重要的調控作用[15-17]。本研究也證實在T2DM患者外周血來源的PBMCs中,circRNA_TRMP7的表達明顯增高。通過KEGG分析發現circRNA_TRMP7與NOD樣受體相關信號通路密切相關,而NLRP3是該受體家族的重要成員之一,與炎癥反應密切相關,從而提示circRNA_TRMP7可能參與T2DM牙周組織炎癥的發生。

NLRP3炎癥小體是由NLRP3識別受體蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和半胱天冬酶-1前體(pro-caspase-1)組成,廣泛地存在于大量免疫細胞中。誘導炎癥小體的激活和caspase-1的活化,會引發炎癥因子IL-1β、IL-18的切割成熟和分泌[18-19]。有學者報道,在牙周炎患者牙周組織中,巨噬細胞內的NLRP3和IL-1β表達明顯增高[20]。本研究發現在口內檢查未發生牙周病的T2DM小鼠牙周組織中,NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和 IL-18表達較高。體外實驗也證實,NLRP3和Caspase-1在T2DM小鼠的M1型巨噬細胞中表達較高,細胞上清中的IL-1β和IL-18分泌較多。提示在小鼠口腔亞健康狀態下,NLRP3炎癥小體已被激活。通過siRNA干預證實,circRNA_TRMP7對NLRP3炎癥小體激活具有正向調控作用。綜上所述,circRNA_TRMP7和NLRP3炎癥小體可能成為精準預防T2DM牙周組織炎癥發生的生物標記物。