雷公藤甲素對舌鱗癌細胞自噬的影響及相關機制研究

楊吉壘 杜艷秋 溫曉霞 劉華蔚

雷公藤甲素(Triptolide,TP)是從中藥雷公藤中提取的有效單體,具有免疫調節、抗炎等經典作用[1]。隨著研究的深入,大量實驗表明雷公藤甲素還可通過各種途徑發揮抗腫瘤作用。研究證實雷公藤甲素能夠抑制線粒體已糖激酶II從而誘導頭頸部腫瘤焦亡[2]。在卵巢癌細胞中,雷公藤甲素能夠抑制JAK2/STAT3信號,通過ROS生成誘導致死性自噬[3]。本研究通過一系列體外實驗,研究雷公藤甲素對人舌鱗狀細胞癌自噬的影響,并研究自噬在其抗腫瘤過程中的作用以及可能的信號轉導途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞以及主要試劑

人舌鱗癌細胞系CAL-27和SCC-25(中國科學院細胞研究所);TP(Sigma公司,美國);DMEM高糖液體培養基、F12液體培養基、青霉素/鏈霉素雙抗、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司,美國);四甲基偶氮唑藍(MTT)粉末(南京生興生物技術有限公司);AnnexinV-PI細胞凋亡雙染試劑盒(Becton Dickinson公司,美國);MDC熒光染色試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司);ECL超敏化學發光試劑盒(南京碧云天生物技術研究所);LC3、ATG3、ATG7、PARP、cleaved PARP、Caspase-9、cleaved Caspase-9、STAT3、PIM-1、β-actin抗體、HRP 標記山羊抗鼠/抗兔 IgG(Abcam 公司,英國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 CAL-27細胞使用高糖DMEM培養基(含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素),SCC-25細胞使用F12培養基(含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素)。恒溫CO2培養箱(5%CO2,37 ℃)培養,細胞密度達到70%～85%時傳代,使用對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MDC染色法測定細胞自噬情況 分別取生長狀態良好且對數生長期的CAL-27細胞和SCC-25細胞,按5×104個細胞/孔的密度接種于24 孔板爬片上,用終濃度10 μg/L的TP分別處理細胞24 h后,避光加0.05 mmol/L的MDC染液(100 μL/孔)避光室溫孵育約40 min,用抗熒光猝滅劑封片,激發波長為355 nm和發射波長為512 nm的綠色熒光進行觀察拍照。

1.2.3 MTT比色法測定細胞存活率 將CAL-27細胞接種于96 孔板(195 μL/孔),恒溫CO2培養箱(5%CO2,37 ℃)中孵育24 h,。細胞貼壁后,以每孔5 μL的體積加入TP(終濃度為2.5、5、10、15、20、30 μg/L),每組濃度設3 個平行孔(空白組加入5 μL的DMSO),繼續培養48 h。避光加入MTT工作液(5 mg/mL,20 μL/孔),在細胞培養箱中靜置反應4 h。棄盡96 孔板中的溶液,向每孔中加入120～150 μL DMSO溶液,待結晶完全溶解后,使用酶聯免疫檢測儀在570 nm波長處檢測各孔的吸光度值。細胞增殖抑制率=(對照組A570值-TP處理組A570值)/對照組A570值100%。

1.2.4 Western Blot實驗測定細胞中相關蛋白表達情況 取處于對數生長期且狀態良好的CAL-27細胞接種至六孔培養板中,待細胞完全貼壁后,換含有不同濃度TP(5、10、20 μg/L)的培養基作用不同時間(12、24、48 h)。收集細胞并提取蛋白,使用BCA法進行蛋白定量,每孔上樣30 μg,8%～12%SDS-PAGE凝膠電泳分離目標蛋白,濕轉至PVDF膜上,5%現配脫脂奶粉室溫封閉液封閉1 h,TBST洗脫3 次,一抗(1:10 000稀釋)4 ℃孵育過夜,TBST洗脫3 次,二抗(1:1 000稀釋)室溫孵育2 h,TBST洗脫,ECL化學發光顯色,Bio-Rad凝膠成像分析儀(Gel Doc XR,伯樂,美國)中曝光,成像。使用Image J系統定量分析目的條帶。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 取處于對數生長期且狀態良好的CAL-27細胞接種至六孔培養板中,待細胞完全貼壁后,換含有不同濃度TP(5、10、20 μg/L)的培養基作用不同時間(12、24、48 h)。收集培養基,并用無EDTA的胰酶消化細胞,終止后所得懸液與細胞原培養基以1 000 r/min的條件離心5 min,棄盡上清,以500 μL 1×Binding Buffer輕柔吹散細胞沉淀,每組樣品中再分別避光加入5 μL Annexin V和5 μL PI染色液?；靹蚝?避光靜置染色20 min,并在2 h內通過流式細胞儀(Invitrogen Attune CytPix,賽默飛,美國)完成所有檢測并分析結果。

1.3 統計方法

2 結 果

2.1 TP對舌癌細胞的自噬誘導作用

經過TP(5 μg/L,24 h)處理的舌癌細胞出現明顯的空泡現象,這是自噬的典型表現之一[4]。MDC染色發現TP處理過的細胞熒光強度明顯增加,說明TP處理的細胞中有大量自噬泡的形成,TP可能誘導舌癌細胞發生了自噬(圖1A)。進一步驗證TP對舌癌細胞自噬的影響,分子水平Western Blot實驗顯示,隨著TP作用時間(12、24、48 h)和作用濃度(5、10、20 μg/L, 24 h)的增加,自噬標志蛋白LC3、Atg3、Atg7表達均明顯上調,與對照組相比具有顯著性差異(圖1B、C)。說明TP能夠誘導舌癌細胞發生自噬,并且呈現時間和濃度依賴性。

圖1 雷公藤甲素誘導TSCCs自噬Fig 1 Triptolide induces autophagy of TSCCs

2.2 TP對CAL-27細胞凋亡的影響

MTT實驗發現TP對CAL-27細胞的殺傷作用呈現濃度依賴性,TP作用48 h對細胞的IC50為12.39 μg/L(圖2A)。流式細胞術發現TP處理后的CAL-27細胞發生凋亡,隨著TP作用時間(12、24、48 h)和作用濃度(5、10、20 μg/L,24 h)的增加,CAL-27的凋亡率不斷增加,呈現時間和劑量依賴性(圖2B)。隨著TP作用時間(12、24、48 h)和作用濃度(5、10、20 μg/L,24 h)的增加,凋亡相關蛋白PARP和Caspase-9剪切體表達明顯上調,與對照組有顯著性差異(圖2C～D)。以上結果充分說明,TP能夠誘導口腔癌CAL-27細胞凋亡。

圖2 雷公藤甲素誘導CAL-27細胞發生凋亡Fig 2 Triptolide induces apoptosis of CAL-27 cells

2.3 雷公藤甲素通過自噬誘導CAL-27細胞發生凋亡

自噬與凋亡均為細胞生命活動的重要調控機制,參與眾多生理病理過程,二者的關系復雜,各自的調控通路之間發生交聯,形成復雜調控網絡,共同維持細胞內環境的動態平衡[8]。有文獻報道[9]自噬與凋亡的關系可分為3 種:自噬與凋亡互不干涉,自噬誘導凋亡,自噬抑制凋亡。為進一步研究TP誘導的自噬與凋亡的關系,選擇自噬抑制劑氯喹(CQ)以及巴伐洛霉素A1(BafA1)處理口腔癌CAL-27細胞,結果顯示自噬抑制劑預處理細胞2 h后,能夠減少TP(10 μg/L,24 h)誘導的細胞凋亡,與對照組相比,自噬抑制劑組細胞凋亡發生率顯著下降(圖2A),同時在分子水平得到了類似的結論,自噬抑制劑組凋亡蛋白PARP和Caspase-9剪切體表達明顯下調,與對照組相比有顯著性差異(圖2B～C)。說明在口腔癌細胞中,雷公藤甲素通過自噬誘導細胞凋亡,發揮抗腫瘤作用。

2.4 雷公藤甲素通過PIM1-STAT3信號通路誘導CAL-27細胞自噬

為了確定雷公藤甲素誘導口腔癌細胞發生自噬的機制,Western Blot實驗檢測STAT3-PIM-1信號通路相關蛋白表達情況,結果顯示TP處理過的CAL-27細胞STAT3和PIM-1信號通路被抑制,隨著TP作用時間(12、24、48 h)和作用濃度(5、10、20 μg/L,24 h)的增加,STAT3和PIM-1蛋白表達水平顯著下調(圖4A～B),呈現一定的時間和劑量依賴性。說明雷公藤甲素可能通過調控PIM1-STAT3信號通路,從而誘導CAL-27細胞發生自噬。

圖4 雷公藤甲素通過PIM1-STAT3信號通路誘導CAL-27細胞自噬Fig 4 Triptolide induces autophagy of CAL-27 cells through PIM1-STAT3 signaling pathway

3 討 論

自噬是哺乳動物細胞高度保守的細胞內能量代謝和細胞自我更新的機制,參與很多細胞生理病理過程,在機體穩態維持過程中發揮重要作用[10]。然而,異常的自噬激活可能會導致腫瘤細胞內某些蛋白質和細胞器的降解,而這些物質是腫瘤細胞存活不可或缺的,這種異常的自噬最終導致自噬性細胞死亡,因此自噬可能會成為新的腫瘤治療的靶點,合理利用自噬能有效殺死腫瘤細胞,達到治療腫瘤的目的[11]。自噬所誘導的死亡屬于II型程序性死亡[12],一般認為其具體機制與凋亡有關,有學者認為細胞自噬發生后進一步誘導凋亡從而引起細胞死亡,已有研究表明自噬和凋亡的調控信號通路在許多方面有相互交叉(crosstalk)[13]。本研究證實從雷公藤中提取的單體有效成分雷公藤甲素能夠誘導口腔癌細胞發生自噬,進一步通過自噬抑制劑預處理細胞考察自噬與凋亡的關系,發現自噬位于凋亡上游,且自噬與凋亡有直接聯系,抑制自噬能減少凋亡的發生,說明本論文體系中自噬與凋亡的關系是:自噬誘導凋亡,且自噬位于凋亡上游。

原癌基因PIM1作為蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶參與調控多個信號通路,在腫瘤的發生發展的多個過程中有重要作用。研究發現PIM1與信號轉導和轉錄激活因子(STAT)家族存在相互調節關系[14]。而STAT3信號通路也是調控腫瘤細胞自噬的經典途徑[15]。已有研究證實,缺氧刺激后微膠質細胞會通過STAT3信號通路激活細胞發生自噬性死亡[16],也有研究發現在人類成纖維細胞中,STAT3能夠被IL-27調控,進而影響細胞自噬與凋亡[17]。這充分說明PIM1與STAT3在細胞自噬以及凋亡的發生過程中有著不可忽視的生物學作用,同時也有研究表明自噬很有可能成為口腔癌治療的有效靶點,具有很大的臨床開發潛力[18]。本研究發現雷公藤甲素處理人口腔癌細胞后,會抑制PIM1-STAT3信號通路,誘導腫瘤細胞發生自噬,進而誘導凋亡發揮抗腫瘤作用。

綜上所述,雷公藤甲素能夠誘導口腔鱗狀細胞癌細胞自噬,并進而誘導腫瘤細胞發生凋亡發揮抗腫瘤作用,在這一過程中細胞PIM1-STAT3信號通路被明顯抑制。本研究證實了了雷公藤甲素誘導口腔鱗狀細胞癌細胞自噬與凋亡的關系,并初步探討了相關機制,為雷公藤甲素在臨床上更廣泛的使用提供了一定的理論基礎。