超聲功率對小麥醇溶蛋白-膳食多酚共價復合物結構及功能性質的影響

曹佳興，朱海蘭，王君榮，張健豪，張國治,4,*

（1.河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2.鄭州科技學院食品科學與工程學院，河南 鄭州 450001；3.上海交通大學農業與生物學院，上海 201100；4.河南省面制主食工程技術研究中心，河南 鄭州 450001）

為了維持動物蛋白與植物蛋白的消費平衡，提高食品生產的可持續性，近年來植物蛋白的研究備受關注，開發具有優良加工特性的植物蛋白成為現階段的一大研究熱點[1]。麩質蛋白是存在于小麥、黑麥、大麥、黑小麥以及燕麥等谷物中的貯藏蛋白，它對谷物類食品的品質有較大影響[2]。小麥中含有豐富的蛋白質資源，麩質蛋白質量占小麥籽粒干質量的10%～15%，其中醇溶蛋白（gliadin，GL）相對含量為50%～60%[3]。小麥GL是一種三維單肽鏈蛋白，分子質量集中在25～100 kDa，分子內通過氫鍵、疏水相互作用以及靜電相互作用連接[4]。GL具有兩親性和表面活性，可作為活性分子的載體或穩定乳液[5]；由于GL溶解度較低，消化性和抗氧化性較差，限制了其在工業生產中的應用。此外，GL中含有大量的谷氨酰胺和脯氨酸，其結構序列中包含大量抗原表位，這增加了接觸/攝入而引發小麥不耐受癥狀的風險[6]。因此，GL的改性對于拓展麩質蛋白的應用具有重要意義。

在食品工業中，通常使用烘焙、濕蒸、高壓和超聲等加工方法來改善蛋白質的功能性質，但這些方法都存在一定的局限性，甚至可能導致蛋白質的加工性質劣變[7]。膳食多酚是存在于植物中的一種天然活性分子，具有良好的抗氧化性能和藥理作用，常用于蛋白質功能特性的修飾。表沒食子兒茶素沒食子酸脂（(-)-epigallocatechin 3-gallate，EGCG）是綠茶中含量最高、活性最強的兒茶素單體，由3 個苯環、1 個吡喃環和8 個酚羥基組成；這種獨特的化學結構使EGCG具有比其他多酚更為優越的功能特性[8]。在堿性、自由基和酶促氧化環境中，EGCG可與蛋白質中的氨基、巰基、酪氨酸、脯氨酸等活性位點形成共價鍵。

EGCG的共價修飾能有效改善蛋白質的理化特性，但傳統共價反應（包括堿法、自由基法和酶促反應）效率較低、條件苛刻，使蛋白-多酚共價修飾在生產應用中存在較大的局限性。有研究發現，超聲波（ultrasound，US）能使水分子解離產生OH-，從而誘導蛋白質與多酚共價反應[9-10]。此外，US能促進GL空間結構的展開[11]，這為共價反應提供了有利的條件。然而，US所提供的自由基氧化是瞬時的，并且受環境因素影響。此外，US處理功率與蛋白質空間構象以及分子間交聯程度密切相關。因此，研究不同功率的US對共價反應產生的強化效果具有重要意義。

本研究以H2O2/抗壞血酸作為誘發體系，誘導GL與EGCG共價反應，比較不同功率的超聲環境中EGCG對GL的修飾強度；通過多光譜聯用分析GL的結構變化，并對其功能特性進行表征，旨在尋找更高效的蛋白-多酚共價修飾方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥由河南省農業科學院提供。

EGCG、2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical，DPPH）上海麥克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白 上海源葉生物科技有限公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）試劑盒、上樣緩沖液 上海雅酶生物醫藥科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國Sigma公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

凱氏定氮儀 山東還能科技儀器有限公司；F-4500熒光光譜儀 日本日立株式會社；圓二色光譜（circular dichroism，CD）儀 美國Thermo Fisher公司；高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）儀美國Agilent公司；UV-2600紫外-可見分光光度計 日本島津公司；蛋白垂直電泳儀、GS-900凝膠電泳成像系統美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 GL的分離與制備

將小麥粉和乙醚按照1∶ 3（m/V）的比例混合，室溫下磁力攪拌4 h以去除脂肪，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，重復上述操作3 次。將脫脂小麥粉和65%（體積分數，下同）乙醇溶液按照1∶10（m/V）的比例混勻，在室溫下機械攪拌提取24 h以上，然后10 000 r/min離心15 min取上清液。對收集的上清液進行旋轉蒸發處理，在-20 ℃冰箱靜置后凍干。利用全自動凱氏定氮儀測定GL含量。

1.3.2 共價復合物制備

參照Xu Haoxie等[12]的方法，將抗壞血酸和H2O2溶于由6 5%乙醇溶液溶解的G L 溶液，室溫下攪拌（600 r/min、30 min）。然后將45.3 mg EGCG加入混合物中進行自由基反應，同時對反應體系進行超聲處理（25 ℃、2 h），US功率分別為0 W及240、360、480、600 W，分別記作GE及GE-US（GE240、GE360、GE480、GE600）；對照組（GL）不進行超聲以及共價反應。反應結束后使用截留分子質量為8 000 Da的透析袋透析72 h除去未反應的EGCG。所有樣品30 ℃減壓濃縮后凍干處理，將制備的共價復合物于-40 ℃冰箱中保存。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-PAGE分析

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-PAGE參照Liu Xiangju等[13]的方法稍作修改。濃縮膠和分離膠質量分數分別為12.5%和5%，凝膠厚度為1.5 cm。使用超純水溶解蛋白質樣品，取適量樣品溶液與4×還原上樣緩沖液/5×非還原上樣緩沖液混合，煮沸8 min使蛋白質變性，10 000 r/min離心5 min后收集上清液上樣。上樣量為每孔15 μL，調整電壓80 V，待溴酚藍指示劑移至分離膠，調整電壓為120 V至電泳結束。電泳結束后使用考馬斯亮藍R-250進行染色，脫色后使用GS-900凝膠成像系統掃描分析。

1.3.4 HPLC分析

根據Ma Ling等[14]的方法進行HPLC分析。樣品使用SDS溶液溶解后過0.45 μm濾膜，過濾后注入2 mL樣品瓶中。使用含0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）的乙腈溶液（體積分數為20%）洗脫，流速為0.5 mL/min，檢測波長設定為280 nm。

1.3.5 多酚結合率測定

參照金花等[15]的方法測定樣品的多酚結合率，取0.5 mL樣品溶液與2.5 mL Folin-Ciocalteu試劑混合，避光反應5 min。加入2 mL 75 mg/mL Na2CO3溶液繼續避光反應2 h，測定760 nm波長處的吸光度。以不同質量濃度的EGCG溶液繪制標準曲線，按照公式（1）計算多酚結合率。

1.3.6 游離巰基/酪氨酸含量測定

使用Tris-Gly緩沖液溶解樣品，得到5 mg/mL溶液。取3 mL樣品溶液與0.03 mL ELLMA試劑（8 mg 5,5-二硫代-雙-(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）溶解于2 mL Tris緩沖液中）迅速混勻，避光反應30 min，測定412 nm波長處的吸光度。按照公式（2）計算游離巰基含量。

式中：D為稀釋系數；ρ為樣品質量濃度/（mg/mL）。

酪氨酸含量的測定參照Liu Fuguo等[16]的方法。將1 mL樣品溶液（1 mg/mL）與1 mL硝酸混合，50 ℃水浴加熱15 min。冷卻后加入4 mL無水乙醇和4 mL NaOH溶液（5 mol/L）混勻，分別測定360 nm和430 nm波長處吸光度。按照公式（3）計算酪氨酸含量。

1.3.7 CD分析

使用磷酸鹽緩沖液（pH 7）溶解樣品，使樣品質量濃度為0.2 mg/mL。取適量樣品溶液置于光程為0.5 mm的比色皿中，于190～260 nm波長范圍內在25 ℃、通氮氣的條件下掃描CD圖譜。設置條件為：步長1 nm，單次掃描時間2 s，平行測定3 次。

1.3.8 紫外光譜分析

參考呂思瑤等[17]的方法，使用UV-2600紫外-可見分光光度計對樣品進行紫外光譜采集。樣品質量濃度為0.25 mg/mL。設置波長檢測范圍為255～285 nm。以65%乙醇溶液作為參比溶液，平行采集3 次。

1.3.9 溶解度測定

準確稱量100 mg樣品，與5 mL超純水混合，通過渦旋攪拌使樣品分散均勻。在恒溫水浴搖床中振蕩30 min后，10 000×g離心收集上清液。取0.1 mL上清液加入5 mL考馬斯亮藍試劑，充分振蕩混合，避光反應10 min后測定595 nm波長處的吸光度。以牛血清白蛋白繪制標準曲線，計算可溶性蛋白質量濃度，按式（4）計算水溶性。

1.3.10 表面疏水性測定

參考王啟明[18]的方法，使用溴酚藍結合法測定樣品的表面疏水性，溴酚藍結合量越高，樣品的表面疏水性越好。用超純水溶解樣品，取1 mL樣品溶液（2.5 mg/mL）與1 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7）和200 μL溴酚藍溶液充分混合均勻，離心取上清液，測定595 nm波長處的吸光度。按照公式（5）計算溴酚藍結合量。

式中：A0和A分別為磷酸鹽緩沖液和樣品的吸光度。

1.3.11 抗氧化性測定

1.3.11.1 ABTS陽離子自由基清除能力

將5 mL ABTS溶液（7.44 mmol/L）與88 μL過硫酸鉀溶液（2.6 mmol/L）混合均勻，靜置18 h，作為ABTS陽離子自由基儲備液。將儲備液根據需要稀釋，取2 mL樣品溶液（2 mg/mL）與4 mL稀釋后的ABTS陽離子自由基溶液避光反應10 min，測定734 nm波長處吸光度。以樣品與過硫酸鉀混合液作為空白對照，ABTS陽離子自由基清除率按照公式（6）計算。

式中：A0為ABTS工作液的吸光度；A為反應液的吸光度；Aw為空白對照的吸光度。

1.3.11.2 DPPH自由基清除能力

使用95%乙醇溶液配制DPPH工作液（1 mmol/L），然后將3 mL樣品溶液（2 mg/mL）與3 mL DPPH工作液溶液混合，避光反應30 min后測定517 nm波長處的吸光度。以95%乙醇與樣品的混合溶液（1∶1，V/V）作為空白對照，DPPH自由基清除率按照公式（7）計算。

式中：A0為DPPH工作液的吸光度；A為反應液的吸光度；Aw為空白對照的吸光度。

1.3.11.3 鐵離子還原能力

將醋酸鈉溶液（0.3 mol/L、pH 3.6）、10 mmol/L三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）、FeCl3（20 mmol/L）按照10∶1∶1的體積比混勻，37 ℃避光水浴2 h，作為鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）工作液。將10 μL樣品溶液（2 mg/mL）與300 μL FRAP工作液混勻，37 ℃水浴反應30 min，測定593 nm波長處吸光度。

1.3.12 消化性測定

模擬消化參照Li Tanghao等[19]的方法并進行修改，使用45 mmol/L NaCl溶液溶解樣品，使樣品質量濃度為2 mg/mL。將樣品溶液與胃蛋白酶置于37 ℃恒溫水浴鍋中穩定30 min，然后將胃蛋白酶加入樣品溶液中（m（胃蛋白酶）∶m（樣品）＝0.03∶1.00）。分別于胃蛋白酶反應60 min和120 min時收集反應產物，立即加入20 μL 2 mol/L NaHCO3溶液終止反應。胃消化120 min時使用NaHCO3調節至pH 7，然后加入模擬腸液（V（模擬腸液）∶V（樣品溶液）＝0.025∶1.000；模擬腸液為2.5 g胰蛋白酶和10 mg膽汁提取物混合，使用NaHCO3溶液定容至25 mL）繼續進行消化反應。分別于胰蛋白酶消化30 min和60 min時收集消化產物，并立即100 ℃水浴滅酶。所收集的樣品使用BCA試劑盒檢測蛋白質量濃度，按照公式（8）計算蛋白質消化率。

式中：ρ0和ρ分別表示未消化和消化后的蛋白質量濃度/（g/mL）。

1.4 數據統計與分析

采用Image Lab軟件分析電泳圖像；使用SPSS 26.0軟件進行數據的單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。使用Origin 2022軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 超聲功率對GL-EGCG共價復合物分子亞基的影響

通過SDS-PAGE觀察蛋白質分子的亞基遷移速率以及聚集程度。根據遷移速率差異，GL亞基主要包括α-/β-亞基、γ-亞基以及ω-亞基。如圖1所示，相較于GL，GE以及GE-US的亞基分布無明顯變化，說明共價反應后無小分子亞基產生，也未出現大分子聚集；但共價復合物的亞基均出現明顯偏移，蛋白質條帶在凝膠上的遷移速率變慢，這是由于GL與EGCG共價結合后相對分子質量增加導致的[20]。超聲環境下形成的共價復合物在凝膠上的遷移速率進一步變慢，其中GE360和GE480亞基明顯偏移；因此推測在360 W和480 W超聲環境中EGCG對蛋白質的修飾效果較強。非還原SDS-PAGE中，GE和GE-US在35 kDa處出現新的條帶c，此外，大于180 kDa處的條帶顏色加深。由于非還原SDS-PAGE過程中保留了二硫鍵，推測共價反應促進了蛋白質之間二硫鍵的交聯，從而使亞基發生聚合[21]。此外，GE600的條帶a以及條帶c顏色略有加深，且在還原SDS-PAGE中，GE600條帶偏移效果與GE無明顯差異，說明600 W處理時共價復合物的聚合效果明顯，這可能是由于高功率的US促進了巰基的氧化以及鏈內二硫鍵的形成，增加了蛋白質分子結構的穩定性[22]，從而限制了空化剪切以及EGCG的進一步修飾。

圖1 不同功率下共價復合物的還原SDS-PAGE（A）和非還原SDS-PAGE（B）圖Fig.1 SDS-PAGE (A) and non-reducing SDS-PAGE (B) diagrams covalent complexes at different power

2.2 超聲功率對GL-EGCG共價復合物分子質量的影響

如圖2所示，GL的保留時間為24.15 min，而GE的保留時間縮短至24.06 min，由此可知GL與EGCG的共價反應形成了相對分子質量更大的復合物，這與Zhang Kangyi等[23]的報道一致。相比于GE，GE-US的保留時間均出現不同程度的縮短，其中GE480的保留時間縮短至23.91 min，說明GE-US共價復合物的相對分子質量更大，這與SDS-PAGE分析結果相印證。

圖2 不同功率下共價復合物的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of covalent complexes at different power levels

2.3 超聲功率對GL-EGCG共價復合物多酚結合率的影響

如表1所示，GE反應體系中多酚結合率為22.78%。隨著超聲功率的增加，多酚結合率先升高后降低，并在480 W時達到最高（33.75%），可見超聲環境更有利于共價反應的進行。US產生強烈的剪切力和空化效應，能有效減弱蛋白質分子之間的弱聚集效應，這在牛血清白蛋白（500 W、0～30 min、20 kHz、0～4 ℃）和對蝦蛋白（300 W、0～35 min、20 kHz、20 ℃）中得到證實[24-25]；此外，空化效應和剪切力能夠破壞分子內的氫鍵相互作用，引起蛋白質去卷曲化，這有利于蛋白質空間構象的舒展[26]。在該過程中，蛋白質的結構變化可能暴露出新的反應位點，更有利于被多酚識別。有研究表明，超聲環境促進了水分子和H2O2的解離，增加了反應體系中羥自由基的含量；這些自由基可氧化蛋白質的部分側鏈基團，從而促進共價反應的進行。當功率增至600 W時多酚結合率下降，這與SDS-PAGE和HPLC的分析結果相印證，說明高強度的超聲環境對EGCG與GL共價反應的增強效果有限；推測高強度超聲產生的空化效應加劇了蛋白質的氧化，促進了分子內二硫鍵的形成以及蛋白質分子的重新聚集[27]，從而限制了共價反應。

表1 多酚結合率及蛋白質二級結構相對含量Table 1 Polyphenol-binding ratio and protein secondary structure contents

2.4 超聲功率對GL-EGCG共價復合物游離巰基和酪氨酸含量的影響

蛋白質側鏈氨基酸容易被自由基氧化進而與多酚發生親核加成反應，因此通過檢測游離巰基和酪氨酸含量的變化可分析EGCG與GL的相互作用。如圖3所示，相較于GL，GE的游離巰基和酪氨酸含量顯著降低，這是由于這些氨基酸殘基被自由基氧化形成反應位點，與EGCG通過共價鍵連接。相較于GE，GE-US的游離巰基和酪氨酸含量減少，這可能是由于在空化效應和EGCG修飾的共同作用下，GL的空間結構發生了更劇烈的改變，使部分基團被重新包裹。Zhang Kangyi等[11]對小麥醇溶蛋白進行超聲預處理，發現蛋白質內游離巰基含量增加。推測超聲環境下的共價反應消耗了更多的游離巰基。當超聲功率為600 W時，共價復合物中酪氨酸含量增加，這可能是由于高強度的空化效應導致部分巰基被氧化成二硫鍵，限制了共價反應對酪氨酸的消耗。

2.5 超聲功率對GL-EGCG共價復合物二級結構的影響

通過對CD進行擬合計算分析蛋白質的二級結構變化。如表1和圖4所示，GL的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲相對含量分別為20.98%、40.57%、19.78%、18.67%，其中β-折疊為GL的主要二級結構。與GL相比，GE中的α-螺旋和無規卷曲結構相對含量降低，而β-折疊和β-轉角相對含量增加，可見共價相互作用改變了GL側鏈以及分子內的氫鍵作用；此外，EGCG與GL共價結合的過程可能促進了氨基酸側鏈對極性基團的吸附，從而使β-轉角的相對含量增加[28]。而GE-US中α-螺旋相對含量進一步降低，說明超聲環境下的共價反應對蛋白質的有序結構破壞更劇烈。這是因為US能夠抑制共價復合物之間的氫鍵相互作用，促進α-螺旋無序化[29]，從而更有利于蛋白質結構的展開。這種松散結構對共價反應的進行更有利。但超聲功率增強至360 W以上時，復合物的α-螺旋相對含量降低不明顯，這可能是由于蛋白質分子間的二硫鍵交聯限制了空化效應和共價作用對其有序結構的破壞。

圖4 不同功率下共價復合物的CD圖譜Fig.4 CD spectra of covalent complexes at different power levels

2.6 超聲功率對GL-EGCG共價復合物三級結構的影響

蛋白質中的芳香族氨基酸使蛋白質在270～280 nm波長處存在特有的紫外吸收，通過對吸收峰強度的分析可判斷共價相互作用程度，而最大吸收/發射波長的分析可用于判斷蛋白質三級結構變化。如圖5所示，GL的吸收峰集中在260～290 nm波長處，這對應于GL中酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基的π-π*越遷[30]。與EGCG共價結合后，GE的紫外吸收明顯增強，并且伴隨藍移；說明GL的空間結構發生改變，芳香族氨基酸的空間位置轉移，暴露于周圍的溶劑中[31]。此外，相較于GE，GE-US的紫外吸收增強，并且隨著超聲功率的增大吸光度增加。這可能是由于超聲環境中EGCG的修飾作用更強烈，導致GL的空間結構進一步改變。

圖5 不同功率下共價復合物的紫外光譜Fig.5 Ultraviolet spectra of covalent complexes at different power levels

2.7 超聲功率對GL-EGCG共價復合物水溶性的影響

蛋白質的水溶性決定了其加工性能，較差的水溶性通常會限制蛋白質在工業生產中的應用。如圖6所示，天然的GL水溶性僅為33.23%，而GE的水溶性顯著提高，這是由于EGCG中的羥自由基更容易與水分子發生氫鍵相互作用，從而增強了共價復合物的水化作用。相較于GE，GE-US的水溶性得到進一步改善，其中GE240的水溶性分別比GL和GE提高了27.89 個百分點和10.97 個百分點。GE-US共價復合物溶解度提升的原因主要是超聲空化效應、剪切力和EGCG共價修飾的協同效應；較高的酚羥基含量使這些復合物更容易與水分子發生相互作用。有研究表明EGCG的共價修飾能夠減小蛋白質粒徑[32]，使蛋白質的比表面積增大，從而有利于蛋白質與水分子接觸[33]。然而，隨著超聲功率的進一步增大，共價復合物的水溶性降低，這可能時由于高強度超聲促使蛋白質形成不穩定的聚合體，減小蛋白質比表面積的同時掩蓋了部分親水基團，不利于蛋白質與水分子之間的相互作用。

圖6 不同功率對共價復合物水溶性的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the water solubility of covalent complexes

2.8 超聲功率對GL-EGCG共價復合物表面疏水性的影響

表面疏水性可用于判斷GL結構的舒展程度。如圖7所示，共價反應后，GL的溴酚藍結合量由104.86 μg提高至110.71 μg，由此可知在EGCG的共價修飾下蛋白質的空間結構展開，疏水區域暴露，從而使其溴酚藍結合量增加。在超聲環境中共價復合物的表面疏水性顯著降低，這可能是由于蛋白質的部分疏水基團作為反應位點參與EGCG的共價反應，使GL表面疏水基團減少。此外，GE-US共價復合物中的酚含量較高；有研究認為，多酚中的苯環和酚羥基能促進蛋白質與多酚之間的非共價相互作用，間接限制蛋白質空間結構的擴張[34]；同時，高強度的超聲還能促進共價復合物之間二硫鍵的交聯，這也可能限制疏水基團在反應過程中的轉移。當超聲功率增大時，共價復合物的表面疏水性呈現上升趨勢，但仍低于GL和GE，這可能是由于高強度的超聲所提供的剪切力能夠打破由EGCG帶來的空間位阻[35]，從而增加疏水基團的暴露量。

圖7 不同功率對共價復合物表面疏水性的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on the surface hydrophobicity of covalent complexes

2.9 超聲功率對GL-EGCG共價復合物抗氧化性的影響

通過DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除實驗結合FRAP分析共價復合物的抗氧化性能差異。如圖8所示，天然的GL抗氧化性能較差，而共價復合物的抗氧化活性均明顯增強。有研究表明膳食多酚能有效改善食品的抗氧化性能，這主要與其化學結構中所含酚羥基的數量有關[36]。每個EGCG分子含有8 個酚羥基；自由基誘導共價反應通過羥自由基氧化蛋白質產生大分子自由基，與酚羥基的鄰位和對位形成共價鍵，這一過程中EGCG的自由基清除能力最大程度地被保留。GE-US共價復合物的抗氧化性隨著超聲功率的增大先增加后降低，至360、480 W時，DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力及FRAP最強，這一結果與2.3節中多酚結合率的變化趨勢相似。Chen Yichun等[37]通過研究不同濃度膳食多酚對蛋白質-多酚復合物抗氧化性的影響，發現復合物中多酚的濃度決定了其抗氧化性。根據對側鏈基團、二級結構和三級結構的分析，推測GE-US抗氧化性的改善與超聲-共價反應產生的協同效應密切相關。相較于GE，超聲處理使GL表面出現更多的識別位點，更有利于蛋白質與多酚之間形成共價連接；但超聲功率增大至600 W時GE600的抗氧化性大幅降低，這可能是因為600 W的超聲環境不利于GL與EGCG的共價反應。

圖8 共價復合物抗氧化性能分析熱圖Fig.8 Heatmap analysis of antioxidant properties of covalent complexes

2.10 超聲功率對GL-EGCG共價復合物消化性的影響

如圖9所示，在胃消化60 min時共價復合物的消化率遠高于GL，由此可知，與EGCG共價結合后GL的消化率顯著提高，這可能是因為GL的結構發生改變，使其更容易被酶水解。然而有研究發現，與部分多酚類物質（原花青素、縮合單寧）復合會降低蛋白質的消化率[38]，本研究結果與之不同，可能的原因是蛋白質的消化性能與其結構密切相關。另外，反應過程中部分酚類化合物與蛋白質之間以非共價鍵相連接，由于消化過程中蛋白質構象的改變，這些酚類物質被釋放，消化酶與這些被釋放的多酚發生相互作用從而使酶活性被抑制。在同一階段，GE-US的消化率大多略高于GE。由紫外光譜分析可知，超聲處理促進了共價復合物中芳香族氨基酸的暴露，而芳香族氨基酸含量與蛋白酶的酶切位點密切相關[39]，由此推測，超聲處理增加了蛋白分子表面的酶切位點。但胃消化60 min時GE360的消化率明顯低于GE，這可能是由于在該超聲環境中共價反應消耗/掩蓋了大量胃蛋白酶的作用位點，如賴氨酸和精氨酸殘基，導致胃蛋白酶無法快速識別目標蛋白。

圖9 共價復合物的消化性分析Fig.9 Digestibility analysis of covalent complexes

3 結論

本研究通過超聲協同H2O2/抗壞血酸氧化體系促進EGCG與GL的共價反應，并對共價復合物進行了結構分析及功能表征。研究發現，超聲環境下更有利于EGCG與GL共價反應的進行，當功率為480 W時，GL的多酚結合率最高，比GE提高了10.97 個百分點。在超聲環境中共價反應消耗了更多的側鏈基團；蛋白質的空間結構發生劇烈的變化，其中有序的α-螺旋相對含量減少，芳香族氨基酸和疏水性氨基酸殘基發生轉移，其結構穩定性進一步降低。相比于傳統共價反應，超聲輔助共價修飾在蛋白質的功能性改良方面有更大優勢；240 W超聲環境中形成的共價復合物水溶性最強，比GL提高了27.89 個百分點；在本研究的消化環境中，超聲輔助共價修飾蛋白質消化率及水解度更高。由于US與自由基氧化的協同效應增加了GL對活性分子的負載量，使其抗氧化性得到改善。本實驗通過調整不同超聲功率輔助GL與EGCG進行共價反應，為提高多酚的生物利用率、拓寬共價修飾在食品工業生產中的應用提供了更多的可能，但US對于共價反應的強化機制還需要進一步研究。