乳酸菌發酵花茶的制備工藝優化及其抗氧化活性研究

祝曼麗，鄭真姐，魏琳芽，劉嬌，許云賀，張莉力*

錦州醫科大學食品與健康學院（錦州 12100）

玫瑰花富含黃酮、總酚、氨基酸、微量元素、揮發油、多糖等活性成分[1]，具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、鎮靜安神等功效，被廣泛應用在食品、藥品、保健品等領域[2-5]。洛神花又名玫瑰茄，洛神花中含有黃酮、總酚、有機酸等活性成分，具有顯著的抗氧化、抗腫瘤等作用[6]，被廣泛應用茶劑、冷熱飲料、果汁、果醬等方面[7]。蠶豆花中含有槲皮素和山奈酚，有良好的抗氧化活性，臨床上從蠶豆花中提取左旋多巴治療帕金森[8]，具有良好的降血壓活性[9]。近幾年，人們對花茶的需求量顯著增加，花茶相關的產品開發和利用還處于初級階段，產品較單一[10]。

目前，很多人把眼光放在了乳酸菌發酵植物基質上[11]。植物基質發酵可以改善風味，有助于提高抗氧化能力。蘋果汁經乳酸桿菌發酵后抗氧化性有了明顯的提高，乳酸菌發酵植物基質可以提高酚類化合物生物利用[12]，玫瑰干花瓣用乳酸菌發酵后抗氧化能力顯著增強[13]。經過乳酸菌發酵后的玫瑰花抗氧化能力顯著增加[14]。

因此，以玫瑰花、洛神花和蠶豆花為主要原料，以Liquorilactobacillus sataumensisML30和Lactococcus lactis subsp lactisYM34為發酵劑，以模糊評價為指標，利用單因素試驗和響應面試驗優化乳酸菌發酵花茶的最佳發酵工藝優化，并測定發酵過程中黃酮含量、總酚含量、DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力和羥自由基清除能力對其在發酵過程中的抗氧化能力并進行評價，為乳酸菌發酵花茶產品的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

玫瑰花（山東濟南平陰縣）；洛神花（安徽亳州沁園春堂）；蠶豆花（河北保定花辰月夕旗艦店）；黃冰糖（南京甘汁園糖業有限公司）。

研究初步設定玫瑰花和洛神花的比例3∶2、添加量3%、蠶豆花添加量0.02%、黃冰糖添加量8%、菌株比例1∶1、初始pH 5.2、發酵溫度30 ℃、培養時間24 h。

L.satsumensisML30、L.lactis subsp lactisYM34發酵劑（菌保藏于錦州醫科大學微生物實驗室）；L.satsumensisML30種子培養基（紅糖添加量6%、大豆低聚肽添加量0.3%、胡蘿卜汁添加量7%、磷酸氫二鉀的添加量0.2%、發酵溫度30 ℃、初始pH 6、菌株接種量5%、發酵時間為16～18 h）；L.lactis subsp lactisYM34種子培養基參考李源等[15]。

1.2 主要儀器與設備

SG-C20 K36電磁爐（中山市森高電器有限公司）；DHP-9082恒溫培養箱（蘇州佳寶凈化工程設備有限公司）；JB-VS-1300超凈工作臺（金壇市鑫鑫實驗儀器廠）；PHS-3B精密pH計（上海雷磁儀器廠）；紫外分光光度計（上海滬凈醫療器械有限公司）；LX-B100L立式自動壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫療設備有限公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 花茶制備

按玫瑰花和洛神花的比例3∶2、添加量3%，蠶豆花0.02%放入到水中煮制沸騰，將洛神花挑出放入榨汁機中并加入適量水打碎5 s，過0.125 mm篩子和8層紗布。加入8%黃冰糖在70 ℃下加熱溶解，攪拌均勻，花茶冷卻至室溫，用磷酸氫二鉀調節pH，分裝，在95 ℃下滅菌10 min。

1.3.2 單因素試驗

以制備100 mL的花茶為標準，以模糊評定法[16]為評價指標，模糊評定法中感官評分占60%，菌體密度占40%，所有權數之和為1。權重系數矩陣M=（60%，40%）評價結果為V=MR，R為最大值，根據V的大小來綜合判斷花茶發酵程度。考察乳酸菌發酵花茶菌株接種量（2%，4%，6%，8%和10%）、菌株比例（YM34-ML30比例3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3）、初始pH（pH 4.5，5，5.5，6和6.5）、培養溫度（20，25，30，35和40 ℃）、發酵時間（4，8，12，16和20 h）對乳酸菌發酵花茶品質的影響。

1.3.3 響應面試驗

根據單因素試驗結果，以模糊評定為指標，選出單因素中影響較大的因素，以發酵時間（A）、初始pH（B）、發酵溫度（C）為自變量，以模糊評分（V）為響應值，進行工藝優化試驗，因素與水平如表1所示。

表1 乳酸菌發酵花茶加工工藝響應面試驗因素與水平

表2 感官評分表

1.3.4 感官評價

根據薛寶玲等[17]的感官評價方法，選擇10名感官評價員（5男5女），以乳酸菌發酵花茶的外觀、口感和香味等評價指標對產品進行感官評價，總分為100分。

1.3.5 吸光度的測定

吸光度采用紫外分光光度法[18]，以未發酵的花茶為空白，測菌體密度。

1.3.6 活性成分測定

最佳發酵條件優化的花茶，分別選取0，5，10和15 h四個時間段乳酸菌發酵的花茶，并測定最佳工藝下乳酸菌發酵花茶的黃酮和總酚含量。其中測定黃酮含量參照孫小晶等[19]的方法，標準曲線的方程為y=0.135 6x-0.044 4，R2=0.993 3，重復3次試驗計算乳酸菌發酵花茶中的黃酮含量。總酚含量采用福林酚比色法[20]，標準曲線的方程為y=0.055 5x+0.000 7，R2=0.999 5，重復3次試驗計算乳酸菌發酵花茶中的總酚含量。

1.3.7 抗氧化性測定

分別選取0，5，10和15 h四個時間段乳酸菌發酵的花茶，并測定DPPH自由基，參考Yang等[21]的檢測方法；超氧自由基清除率的研究參考高善行等[22]的檢測方法；羥自由基的清除率參考賈寒冰等[23]的檢測方法。評價乳酸菌發酵花茶的抗氧化活性。

1.4 數據分析

數據統計利用SPSS 22.0版本對試驗數據進行ANOVA單因素方差分析和LSD多重檢驗（P＜0.05），通過SNK檢驗法進行各組間的兩兩差異性比較。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 菌株接種量對乳酸菌發酵花茶的影響

菌株接種量為2%，4%，6%，8%和10%，分析菌株接種量對乳酸菌發酵花茶的影響。如表3所示，菌株接種量過大或過小對吸光度都有很大的影響，菌株接種量小于6%或大于6%時，乳酸菌發酵花茶的吸光度低于正常。當菌株接種量為6%時，乳酸菌發酵花茶的吸光度最高，結合感官評價后的V值也最高，此時得到的產品沉淀少，有一種玫瑰的淡淡清香味（P＜0.05），因此，較優的菌株接種量為6%。

表3 菌種接種量對乳酸菌發酵花茶的影響

2.1.2 菌株比例對乳酸菌發酵花茶的影響

菌株比例為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3，分析菌株比例對乳酸菌發酵花茶的影響。如表4所示，菌株比例為1∶1時，乳酸菌發酵花茶中V值最高，吸光度最高為0.716±0.009，感官評價為79.5±0.47分，均高于其他比例（P＜0.05），在此情況下乳酸菌發酵花茶產品無沉淀，酸甜適中，說明在此菌株比例下，乳酸乳球菌和乳酸桿菌都能很好地生長，因此，選擇菌株比例1∶1。

表4 菌種比例對乳酸菌發酵花茶的影響

2.1.3 初始pH對乳酸菌發酵花茶的影響

初始pH 4.5，5，5.5，6和6.5，分析初始pH對乳酸菌發酵花茶的影響。如表5所示，當pH為6時，乳酸菌發酵花茶中V值最高，得到的產品吸光度和感官評分好（P＜0.05），pH過低，乳酸乳球菌的生長會受到抑制，沒有為乳酸乳球菌創造良好的生長環境，當初始pH過高時，乳酸桿菌的生長又會受到抑制，從而導致乳酸菌發酵花茶的風味不佳。因此，選擇pH 6。

表5 不同pH對乳酸菌發酵花茶的影響

2.1.4 培養溫度對乳酸菌發酵花茶的影響

培養溫度為20，25，30，35和40 ℃，分析培養溫度對乳酸菌發酵花茶的影響。如表6所示，溫度對乳酸菌有較大影響，發酵的溫度過低，菌體不能正常地生長繁殖，在此階段菌體的代謝較慢，當發酵溫度為30 ℃時，菌體的吸光度最高，但花茶的顏色較暗淡、略有苦味，V值不高，當發酵溫度為35 ℃時，吸光度達到0.441，感官評價最高，顏色鮮艷、苦味不重、發酵風味良好，因此，培養溫度選擇35 ℃。

表6 發酵溫度對乳酸菌發酵花茶的影響

2.1.5 發酵時間對乳酸菌發酵花茶的影響

發酵時間為4，8，12，16和20 h，分析發酵時間對乳酸菌發酵花茶的影響。如表7所示，發酵時間越長，吸光度越高，感官評價得分就越低，感官評價下降（P＜0.05），當發酵時間為16 h時，感官評價最高，發酵風味良好、質地均勻、顏色鮮艷且長時間不變色、酸甜適中，V值最高為0.952±0.003（P＜0.05），因此，選擇發酵時間16 h進行后續試驗。

表7 不同發酵時間對乳酸菌發酵花茶的影響

2.2 響應面試驗優化乳酸菌發酵花茶發酵工藝結果

2.2.1 乳酸菌發酵花茶響應面試驗結果

根據單因素試驗結果，選擇發酵時間（A）、初始pH（B）、培養溫度（C）作為考察因素，依據模糊評定法確定V值，各因素試驗設計與結果見表8。

表8 乳酸菌發酵花茶工藝優化響應面試驗設計與結果

2.2.2 回歸模型的建立

如表9所示，利用Design Expert 10.0軟件對試驗數據回歸分析建立方程：V=0.95-0.039×A+0.032×B+0.037 5×C+0.085×A×B-0.028×A×C+0.040×B×C-0.079×A2-0.041×B2-0.089×C2。

表9 乳酸菌發酵花茶工藝優化回歸模型方差分析

表10 乳酸菌發酵花茶抗氧化活性

響應面試驗模型中的A、AB、A2、C2影響差異均極顯著（P＜0.01），B、交互項BC對試驗響應值影響顯著（P＜0.05），C、交互項AC對響應值的影響不顯著（P＞0.05）。由統計學模型可以得出，回歸系數R2=0.958 5，模型校正決定系數Radj2=0.911 8，由此說明該模型可以解釋91.11%響應值的變化，擬合度良好，誤差小，可以用來分析乳酸菌發酵花茶的大眾接受度，具有一定的指導意義。因變量與試驗中所考察的自變量之間的線性關系顯著，說明在此次對花茶發酵工藝條件優化試驗中，試驗數據誤差較小，結果可信。它們之間的主次關系依次為發酵時間＞pH＞發酵溫度。通過響應面優化分析，可得到花茶發酵的最佳發酵條件。根據Design-Expert 8.0.6.1軟件求出回歸模型極值點，結果表明最佳培養條件為發酵時間14.90 h、pH 5.7、發酵溫度35.6 ℃，此時V值為0.952 6。為了方便乳酸菌發酵花茶的制作，將最優條件調整為發酵時間15 h、pH 5.7、發酵溫度36 ℃。經過3次驗證試驗，V值為0.95，活菌數為3.6×108CFU/mL，發酵后的pH為3.8±0.05，這些指標說明該方程與實際情況擬合良好，適合應用于花茶發酵工藝條件的優化。

2.3 花茶發酵過程中活性成分和抗氧化能力分析

2.3.1 花茶發酵過程中活性成分的變化

花茶發酵過程中黃酮和總酚含量變化，結果如圖1所示。黃酮和總酚含量隨著發酵時間的延長而增加，總酚含量在發酵初始階段（0～10 h）增加速度較緩慢，在10～15 h快速增加，在發酵結束時，總酚含量由最初的2.29±0.05 μg/mL增長至3.89±0.09 μg/mL，提高了69.76%，經過去糖基化反應使乳酸菌發酵花茶中有更多的糖基化酚，破壞植物的細胞壁，從而釋放出更多的可溶性共軛或者不溶性酚類化合物，從而導致總酚含量增加[24]。在發酵0～5 h，黃酮含量增長得最快，由1.09±0.04 mg/mL增長至1.20±0.04 mg/mL，隨著發酵時間的延長，黃酮的增長速度減緩，在發酵結束時黃酮增長至1.33±0.04 mg/mL，比發酵前提高了20.54%。酶經過酶解后會破壞細胞壁從而使黃酮更好地釋放出來[25]。在發酵過程中，黃酮類和總酚類物質含量升高，是玫瑰花中的重要的活性生物成分，具有較強的生物活性，是一種天然的抗氧化劑[26]。

圖1 花茶發酵過程中活性物質含量變化

2.3.2 發酵過程中抗氧化活性的變化

乳酸菌發酵后，花茶發酵的DPPH自由基清除率、超氧自由基清除率顯著升高，分別上升了33.44%和6.13%，羥自由基清除率下降了6.63%。DPPH自由基清除能力增加表明微生物發酵可能會提高多酚化合物的可用性，說明乳酸菌發酵花茶具有一定的抗氧化活性。乳酸菌在發酵過程中產生酚類和黃酮類物質能使DPPH清除率的上升，使其抗氧性增強。研究也發現，總酚與清除超氧陰離子能力有顯著的量效關系[27]。

3 結論

乳酸菌發酵花茶的最佳發酵工藝參數是菌株接種量6%、菌株比例1∶1、初始pH 5.5、培養溫度36℃、發酵時間15 h。乳酸菌發酵花茶在發酵過程中，黃酮的含量提高了20.54%，多酚含量提高了69.76%，DPPH自由基清除能力提高了33.44%，超氧自由基清除率提高了6.13%，羥自由基清除率下降了6.63%。結果表明花茶經過乳酸菌發酵后抗氧化能力明顯提高，為后續研究乳酸菌發酵花茶的營養成分奠定理論基礎。