藍莓葉中槲皮素的提取及抗氧化作用

張宏強，李春桃*

錦州醫科大學（錦州 121001）

槲皮素（Quercetin）屬于黃酮醇類化合物，難溶于水，易溶于堿性溶液。槲皮素大量存在于植物的果實、莖、葉中，具有多種生物活性[1]。藍莓葉在《本草綱目》已有記載：“其味苦平，無毒，益精氣，強筋骨，止瀉除睡，久服長生不饑，變白卻老。”藍莓葉已列入中國藥典，可以作為普通食品的原料[2]。此次試驗以藍莓葉為原料提取槲皮素，采用超聲波乙醇提取槲皮素，通過響應面法，探索其最佳提取條件，并對其體外抗氧化活性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

藍莓葉（湖北牧童藍莓科技有限公司）；槲皮素標準品（北京索萊寶科技有限公司）；無水乙醇、甲醇、磷酸、高硫酸鉀（西隴化工股份有限公司）；DM101大孔樹脂（北京索萊寶科技有限公司）；DPPH試劑（合肥千盛生物科技有限公司）；氯化鐵（天津百倫斯生物技術有限公司）；鄰苯三酚（天津市永晟精細化工有限公司）；ABTS溶液（上海尚寶生物科技有限公司）；醋酸銨、硫酸亞鐵（天津市致遠化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

LC-15C高效液相色譜儀（島津儀器蘇州有限公司）；KH-500V超聲波發生器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；FA2004B電子天平（上海精科天美科學儀器有限公司）；SHB-B95A循環水式多用真空泵（陜西太康生物科技有限公司）；DHG-9140電熱鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；DK-98-11A恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；UV752紫外分光光度計（上海精科實業有限公司）；XD-52AA數顯型旋轉蒸發器（上海賢德實驗儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲輔助提取藍莓葉槲皮素工藝

將藍莓葉用高速粉碎機粉碎，過0.125 mm（120目）篩[3]。稱取3.0 g藍莓葉粉末于錐形瓶中，將錐形瓶放置于超聲波發生器中，加入一定量體積分數為75%的乙醇，超聲提取時間30 min后，真空抽濾[4]。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 料液比對藍莓葉槲皮素提取的影響

稱取3.0 g經干燥、粉碎后的藍莓葉放入錐形瓶中，在超聲波溫度50 ℃、超聲功率500 W下提取，以藍莓葉槲皮素提取量為指標，對料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL）進行單因素分析[5]。

1.3.2.2 超聲溫度對藍莓葉槲皮素提取的影響

稱取3.0 g經干燥、粉碎后的藍莓葉放入錐形瓶中，在料液比1∶15（g/mL）、超聲功率500 W下提取，以藍莓葉槲皮素提取量為指標，對超聲溫度40，50，60，70和80 ℃進行單因素分析[6]。

1.3.2.3 超聲功率對藍莓葉槲皮素提取的影響

稱取3.0 g經干燥、粉碎后的藍莓葉放入錐形瓶中，在料液比1∶15（g/mL）、超聲溫度50 ℃下提取，以藍莓葉槲皮素提取量為指標，對超聲功率300，400，500，600和700 W進行單因素分析[7]。

1.3.3 響應面優化試驗

采用 Box-Behnken組合設計，對藍莓葉槲皮素提取條件進行優化，見表1。

表1 響應面試驗因素及水平

1.3.4 藍莓葉槲皮素含量測定

1.3.4.1 色譜條件的選擇

采用C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：45%甲醇；流動相B：55%磷酸水溶液（1%）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：320 nm[8]。

1.3.4.2 對照品溶液制備

精密稱取0.63 mg槲皮素對照品，置于50 mL棕色容量瓶內，加適量50%甲醇，充分搖勻使其溶解，并用甲醇定容至刻度，將其作為對照品儲備液。準確量取1 mL對照品儲備溶液，定容至20 mL容量瓶，制得6.3 μg/mL槲皮素對照品溶液[9]。

1.3.4.3 供試品溶液制備

取0.85 g槲皮素粉末，加50 mL甲醇，放入超聲波發生器中充分攪拌30 min，充分溶解后，用超純水稀釋到一定比例。取上清液以0.45 μm濾膜過濾，取濾液為供試品溶液[10]。

1.3.4.4 線性關系

精密吸取5份對照品溶液，每份吸取2 mL放入安培瓶中，按照上述色譜條件測定槲皮素的含量[11]。以色譜峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（X）為橫坐標，繪制標準回歸曲線。計算得回歸方程Y槲皮素=318.28X+286.87，相關系數R=0.998 7，確定系數R2=0.999 3。結果表明，槲皮素溶液在0.717～49.690 μg/mL之間存在良好的線性關系。

1.3.5 DPPH自由基清除率的測定

避光條件下，取2 mL藍莓葉槲皮素溶液，加入1 mL DPPH-乙醇溶液，混勻后，靜置30 min，在517 nm波長處測定吸光度，以VC、蘆丁為陽性對照，做3次平行試驗[12-13]。按式（1）計算藍莓葉槲皮素DPPH·的清除率。

式中：A0為未加樣品的吸光度；Ai為加樣品后的吸光度；Aj為樣品本身的吸光度。

1.3.6 超氧陰離子自由基清除率能力

取5 mL pH 8.0濃度0.1 mmol/L碳酸鈉于試管中，加入1.0 mL藍莓葉槲皮素溶液和0.4 mL濃度30 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后反應6 min，在328 nm波長處測吸光度。以VC、蘆丁為陽性對照，做3次平行試驗[14-15]。按式（2）計算超氧陰離子自由基清除率。

式中：A0為未加樣品的吸光度；Ai為加樣品后的吸光度；Aj為樣品本身的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比的影響結果

根據圖1顯示，提取量開始隨著料液比的變化，曲線呈現出逐漸上升的趨勢，在比例達到1∶15（g/mL）時圖像出現最高峰。隨著乙醇添加比例的繼續增大，溶液已飽和，提取量逐漸下降。料液比為1∶15（g/mL），提取量最高。

圖1 料液比的影響結果

2.1.2 超聲溫度的影響結果

由圖2可知，隨著超聲溫度的不斷升高，藍莓葉槲皮素提取量不斷增大。當提取溫度達到50 ℃時，藍莓葉槲皮素提取量達到最大；若繼續升高溫度，曲線呈現下降狀態，這可能是因為槲皮素隨著溫度的升高表現出不穩定狀態，因其分子結構被破壞，從而導致提取量的減少。因此確定最佳超聲溫度為50 ℃。

圖2 超聲溫度的影響結果

2.1.3 超聲功率對提取量的影響

由圖3所示，曲線的趨勢表現為先上升，達到最高點后下降。當超聲功率小于500 W時，提取量逐漸增大；最大提取量在超聲功率達到500 W時出現；超聲功率大于500 W時，提取量隨著超聲功率的增大開始減小。提取量總體呈現先上升后下降的變化。因此確定最佳超聲功率為500 W。

圖3 超聲功率的影響結果

2.2 響應面結果與分析

2.2.1 回歸方程的建立與分析

根據單因素試驗結果，超聲波輔助提取藍莓葉槲皮素以75%乙醇為溶劑，最佳料液比1∶15（g/mL）、超聲溫度50 ℃和超聲功率500 W，采用響應面設計三因素三水平優化藍莓葉槲皮素提取條件。響應面試驗設計及結果見表2，分析試驗結果得回歸方程：Y=8.44-0.43A+0.38B+0.48C-0.21AB+0.16AC-0.45BC-1.29A2-0.14B2-0.65C2。

由表3槲皮素提取量回歸方程方差分析可知：P＜0.000 1，該回歸方程模型極顯著；失擬性P=0.808 1＞0.05，無顯性著，說明模型擬合正確；決定系數R2=0.997 7＞0.9，校正系數=0.994 7＞0.9，說明該模型擬合程度較高，該方程可應用于藍莓葉槲皮素的超聲輔助提取工藝研究。由F值可知，影響槲皮素提取量各因素作用大小比較：超聲功率（C）＞料液比（A）＞超聲溫度（B）。

表3 槲皮素提取量回歸方程方差分析

2.2.2 響應面各因素交互作用分析

各因素之間交互作用對槲皮素提取量的影響見圖4～圖6。等高線圖可以直觀反映出交互因素對槲皮素提取量的影響程度。交叉線越平穩，形狀呈圓形，代表交互作用不顯著；而交叉線越陡峭，形狀呈橢圓形，則代表交互作用顯著。固定超聲功率，隨著超聲溫度和料液比的增加，槲皮素提取量呈現先增大后減小的趨勢，曲面坡度較陡，等高線呈橢圓形，則超聲溫度和料液比兩因素交互作用顯著；固定超聲溫度，隨著超聲功率和料液比的增加，槲皮素提取量呈現先增大后減小的趨勢，曲面坡度較陡，等高線呈橢圓形，則超聲功率與料液比兩因素交互作用顯著；固定料液比，槲皮素提取量隨著超聲功率和超聲溫度的升高而降低，曲面坡度陡峭，兩因素作用極顯著。

圖4 超聲溫度和料液比對槲皮素提取量影響的響應面圖和等高線

圖5 超聲功率和料液比對槲皮素提取量影響的響應面圖和等高線

2.2.3 驗證試驗結果

經響應面試驗優化，最終得出藍莓葉槲皮素超聲輔助提取的最優條件：料液比1∶13.773 g/mL，超聲溫度51.288 ℃，超聲功率499.123 W。在此條件下，槲皮素提取量為8.765 mg/g。考慮到實際操作會存在一定誤差，將工藝條件進行優化為料液比1∶15 g/mL、超聲溫度50 ℃、超聲功率500 W。在此條件下，進行3組平行試驗，槲皮素提取量為8.396 mg/g。與響應面試驗優化得出的最大值之間存在4.2%的誤差，說明該模型能較好地預測和分析藍莓葉槲皮素超聲輔助提取的工藝條件。

2.2.4 高效液相色譜法定量結果分析

將經DM101大孔樹脂純化后的藍莓葉槲皮素，通過高效液相色譜儀測定，測定波長為320 nm。從圖7和圖8可知，藍莓葉槲皮素在該分離條件下達到很好的分離效果，槲皮素樣品液在14.5 min處有較好的吸收峰，與槲皮素標準品的出峰時間完全一致，可以確定經提取純化后的樣品為槲皮素。

圖7 槲皮素對照品HPLC圖

圖8 槲皮素樣品HPLC圖

2.3 藍莓葉槲皮素體外抗氧化試驗結果分析

2.3.1 DPPH自由基清除率試驗結果

由圖9可知，在0.5～2.5 mg/mL范圍內，藍莓葉槲皮素對DPPH自由基清除率逐漸增大。當質量濃度達到2.5 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到43.5%，DPPH自由基清除能力低于VC的DPPH自由基清除能力，而高于蘆丁的DPPH自由基清除能力。此后隨濃度增加，三者對DPPH自由基清除能力變化不大。

圖9 藍莓葉槲皮素、VC和蘆丁對DPPH自由基的清除能力

2.3.2 超氧陰離子自由基清除率試驗結果

由圖10可知，在0.5～4.5 mg/mL范圍內，藍莓葉槲皮素、蘆丁、VC對超氧陰離子自由基清除率，隨著濃度的增大而升高。當質量濃度達到4.5 mg/mL時，三者對超氧陰離子自由基清除率達到最大，分別為45.3%，37.4%和85.8%。當這三者濃度相同時，其對超氧陰離子自由基清除率VC最高、藍莓葉槲皮素次之、蘆丁最低。

圖10 藍莓葉槲皮素、VC和蘆丁對超氧陰離子自由基的清除能力

3 結論

通過單因素試驗和響應面試驗的方法，對超聲波輔助提取槲皮素的工藝進行優化。通過單因素試驗和響應面試驗確定最優提取條件：在75%乙醇條件下，料液比1∶15（g/mL），超聲溫度50 ℃，超聲功率500 W。影響槲皮素提取量的因素順序依次為超聲功率＞料液比＞超聲溫度。通過3組平行試驗，槲皮素提取量為8.396 mg/g。與響應面試驗優化得出的最大值之間存在4.2%的誤差，說明該模型能較好地預測和分析藍莓葉槲皮素超聲輔助提取的工藝條件。經高效液相色譜法結果分析得藍莓葉槲皮素提取物中含有槲皮素單體。通過體外抗氧化試驗，藍莓葉槲皮素DPPH自由基清除率為43.5%，對超氧陰離子自由基清除率為45.3%。該研究結果為開發藍莓葉槲皮素抗氧化功能性食品提供理論依據。