EGCG與柚皮素、橙皮苷緩解大鼠便秘的作用機制

唐健，高雅倩，么春艷*，賀可可，李泓穎，肖鵬

1.無限極（中國）有限公司（廣州 510623）；2.杭州醫學院（杭州 310013）；3.健士星生物技術研發（上海）有限公司（上海 200335）

便秘可分為器質性便秘與功能性便秘。器質性便秘是指由于器官發生病理性變化而造成的便秘，如消化道疾病、內分泌代謝疾病等，需要專業的醫學治療。功能性便秘是指由于腸道功能產生暫時性障礙而造成的便秘，臨床主要表現為排便次數少于3次/周，伴有排便間隔時間延長、排便困難等特點，主要與生活規律改變、情緒抑郁、飲食習慣、生活習慣、藥物作用等相關，可通過服用功能性保健食品、改變生活習慣等方式調節改善。功能性便秘在成人尤其老年人群體中存在較高的發病率，研究顯示16%的成人、36%的老年人存在便秘問題[1]。

便秘問題的形成不僅與結腸的神經調節異常相關，同時還與Cajal間質細胞（ICC）功能異常、腸道結構穩定性破壞、平滑肌收縮減緩相關[2-3]。神經系統異常包括膠質細胞退化、神經營養因子（BDNF、GDNF）、5-羥色胺（5-HT）、血清血管活性腸肽（VIP）、P物質（SP）含量紊亂。ICC在胃腸道上具備起搏功能，引導慢波傳播。ICC將胃腸道神經的信號傳遞給平滑肌細胞，從而推動內容物運輸。ICC同時也是肌肉牽張感受器[4]。

因此解決便秘問題，需要運用綜合手段恢復腸道功能。

現有臨床試驗的便秘動物模型結果顯示，長期便秘均伴隨著結腸部位ICC數量降低，功能障礙等。通常選擇c-Kit、SCF作為ICC的檢測指標，因為c-Kit是ICC的特異性標志物，ICC的存活需要適量濃度的SCF，已知通過阻擋SCF與c-Kit結合會降低ICC數目，c-Kit會隨著SCF濃度的下降而減少[5]。ICC與平滑肌之間為連接蛋白Cx43，其密度的變化可以表征神經-ICC-平滑肌整體的穩定性，平滑肌與ICC之間縫隙出現異常時，包括縫隙的增加以及消失，將會破壞信號傳導通路（腸神經—ICC—平滑肌細胞）[6]。肌動蛋白相關蛋白2/3復合體（Arp2/3）是一種與肌動蛋白結合的蛋白，起到模板的作用，促進肌動蛋白的多聚化，Arp2/3復合體在微絲形成過程中發揮重要的調控作用。微絲在細胞骨架形態維持、承受外力、保持細胞內部的有序性方面起重要作用，因而Arp2/3復合體的表達對于腸道平滑肌收縮功能具備表征作用[7]。

黃茶是中國六大茶類之一。黃茶中含有的主要活性成分為茶多酚、生物堿、氨基酸和茶多糖[8]。據報道黃茶具有抗氧化、抗炎發揮抗菌、降糖、降脂等健康功效[9-10]。陳皮是藥食同源食品，活性成分主要為黃酮類、生物堿類、多糖類及揮發油[11]。陳皮在臨床上主要用于治療咳嗽痰多、消化不良、小兒泄瀉和厭食等疾病[12]。在前期試驗研究中發現，黃茶與陳皮可以通過增加糞便質量、數量，提高小腸推進率，緩解大鼠便秘。

現有研究表明黃茶茶多酚具有通便功能，而多酚中含量最高的是EGCG，因而黃茶的通便功能可能與EGCG相關。陳皮黃酮類物質具有很強的生物活性，已有諸多相關研究報道。陳皮中的黃酮類成分以橙皮苷、柚皮素為主，推測陳皮改善便秘與這些成分相關。已有研究中鮮有關于EGCG、柚皮素、橙皮苷的通便機制報道，因此試驗探索EGCG、柚皮素、橙皮苷通便作用機制，為拓寬黃茶、陳皮的開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SD大鼠80只，SPF級，180±20 g，全雄，浙江省醫學科學院[實驗動物生產許可證號SCXK（浙）2019-0002]；黃茶凍干粉、陳皮凍干粉（黃山華綠園科技有限公司）；90% EGCG、95%橙皮苷（上海源葉生物有限公司）；97%柚皮素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鹽酸洛哌丁胺膠囊（西安楊森制藥有限公司）；Ach Elisa試劑盒（南京建成生物工程研究所）；DNase/RNase-Free去離子水、FastQuant RT Kit（With gDNase）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2004電子分析天平（上海奕宇電子科技有限公司）；Cycler480實時熒光定量PCR系統（瑞士Roche）；EG1150C包埋機、RM2235切片機、TP1020脫水機（LEICA公司）；51A011 KD-P組織攤片機（浙江金華科迪儀器設備有限公司）；HGPF-50烤箱（上海躍進醫療器械有限公司）；DP260s達科為染色機（深圳市達科為醫療科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及造模

80只動物隨機分為8組，即對照組（CON組）、模型組（MG組）、柚皮素低劑量組（LN組）、柚皮素高劑量組（HN組）、EGCG低劑量組（LE組）、EGCG高劑量組（HE組）、EGCG與橙皮苷組（EH組）、EGCG與柚皮素組（EN組）。模型組在第1～第7天正常喂養，第8～第11天每日夾尾2次，每次30 min。第12天灌胃7 mg/kg劑量洛哌丁胺，不夾尾。空白組第12天給予等量0.9%生理鹽水（包含5%天MSO），其余期間正常飼養。LN組、HN組、LE組、HE組、EH組、EN組，樣品使用0.9%生理鹽水（包含5% DMSO）溶解，每天僅灌胃1次，灌胃濃度如表1所示。LN組、HN組、LE組、HE組、EH組、EN組在第1～第12天分別灌胃不同樣品，第8～第11天每日夾尾2次，每次30 min。第12天灌胃7 mg/kg劑量洛哌丁胺，不夾尾。

表1 功效成分組合信息

1.3.2 觀察指標

1.3.2.1 乙酰膽堿（Ach）含量測定

第12天灌胃7 mg/kg劑量洛哌丁胺，不夾尾。灌胃洛哌丁胺6 h后，大鼠禁食不禁水6 h，麻醉大鼠，腹主動脈采血，置于抗凝管中，混勻后立即在4 ℃以下以3 000 r/min離心10 min，得到血漿，在-70 ℃保存待測，按照試劑盒要求測定血漿乙酰膽堿（Ach）表達水平。

1.3.2.2 便秘大鼠結腸組織c-Kit mRNA、SCF mRNA、BDNF mRNA、GDNF mRNA、Cx43 mRNA表達水平測定

取100 mg新鮮凍存的大鼠結腸組織，置于5 mL離心管中，加入1 mL RNA hold和0.5 mL裂解液，勻漿；按照RNA提取試劑盒提取總RNA，上機檢測總RNA濃度。總RNA反轉錄cDNA：將總RNA稀釋至150 μg/L，抽取6 μL總RNA，加入4 μL Mix及10 μL無RNA酶水，共20 μL的反應體系；輕輕混勻后在42 ℃孵育10 min，在85 ℃加熱5 s失活，上機檢測cDNA濃度。向各管中加入12.5 μL 2×PCR Taq Mix、0.5 μL 10 μmol/L各基因的引物以及各1 μL相應的cDNA；陰性管中不加模板；各管補加水至25 μL，混勻；置于PCR儀中進行檢測，PCR的統計學分析采用的是相對定量，采用RQ=2^-ΔΔCt算相對表達量。引物系列見表2。

表2 Real-time PCR引物序列

1.3.2.3 免疫組化法分析肌動蛋白（Arp2/3）的表達

結腸組織免疫組化切片經常規脫蠟脫水、磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗、高壓抗原修復、PBS沖洗、3%過氧化氫溶液室溫下孵育15 min、PBS沖洗50 μL，滴加一抗，置濕盒內孵育（37 ℃/1.5 h），用PBS沖洗，滴加二抗，室溫下孵育30 min，滴加顯色液，清水沖洗，染色封片，顯微鏡觀察。光鏡下觀察，細胞質染色呈棕色者判定為陽性細胞。

1.4 數據處理與分析

所有顯示的數據均采用“平均值±標準差”表示，單因素方差分析比較組間差異，用SPSS 16.0進行數據處理，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 乙酰膽堿（Ach）結果

如圖1所示，乙酰膽堿在便秘模型組中含量極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。樣品組的乙酰膽堿水平均極顯著高于便秘模型組（P＜0.01）。乙酰膽堿是對腸道運動有調節作用的神經遞質，通過與腸道M受體結合促使平滑肌收縮[13]，腸道內容物向前推進。結果表明，柚皮素、EGCG、橙皮苷均能通過提升Ach改善便秘。

圖1 不同功效成分組合物對于乙酰膽堿的影響

2.2 c-Kit的mRNA表達結果

便秘模型組的c-Kit的mRNA表達量極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。樣品組的結果均極顯著高于便秘模型組（P＜0.01），低劑量柚皮素（LN組）表現最好，其次是橙皮苷與EGCG組合物（EH組）、低劑量EGCG（LE），結果說明在提高便秘模型大鼠c-Kit表達上，陳皮中的柚皮素、EGCG都是低劑量效果優于高劑量，橙皮苷與EGCG組合物優于柚皮素、EGCG組合物，如圖2所示。

圖2 不同功效成分組合物對于c-Kit mRNA的影響

2.3 SCF的mRNA表達結果

便秘模型組SCF的mRNA表達量極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。樣品組的結果均極顯著高于便秘模型組（P＜0.01），最大劑量柚皮素（HN組）提升SCF表達效果最優，其次是低劑量EGCG（LE組）、柚皮素與EGCG組合物（EN）。上述結果表明在提升SCF表達上，低劑量EGCG優于高劑量EGCG，高劑量柚皮素優于低劑量柚皮素，柚皮素與EGCG組合物優于橙皮苷與EGCG組合物，如圖3所示。

圖3 不同功效成分組合物對于SCF mRNA的影響

2.4 BDNF的mRNA表達結果

便秘模型組的BDNF的mRNA表達量極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。樣品組的結果均極顯著高于便秘模型組（P＜0.01）。橙皮苷與EGCG組合物（EH組）提升BDNF表達效果最優，其次是低劑量柚皮素（LN組）、低劑量EGCG（LE組）。上述結果表明在提升BDNF表達上，低劑量EGCG優于高劑量EGCG，低劑量柚皮素優于高劑量柚皮素，橙皮苷與EGCG組合物優于柚皮素與EGCG組合物，如圖4所示。

圖4 不同功效成分組合物對于BDNF mRNA的影響

2.5 GDNF的mRNA表達結果

便秘模型組的GDNF的mRNA表達量極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。樣品組的結果均極顯著高于便秘模型組（P＜0.01）。低劑量柚皮素（LN組）提升GDNF表達效果最優，其次是高劑量柚皮素（HN組）、低劑量EGCG（LE組）。結果表明在提升GDNF表達上，低劑量EGCG優于高劑量EGCG，低劑量柚皮素優于高劑量柚皮素，橙皮苷與EGCG組合物優于柚皮素與EGCG組合物，如圖5所示。

圖5 不同功效成分組合物對于GDNF mRNA的影響

2.6 Cx43的mRNA表達結果

便秘模型組的Cx43的mRNA表達量極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。樣品組的結果均極顯著高于便秘模型組（P＜0.01）。橙皮苷與EGCG組合物（EH組）提升Cx43表達效果最優，其次是低劑量柚皮素（LN組）、高劑量柚皮素（HN組）。上述結果表明在提升GDNF表達上，低劑量EGCG優于高劑量EGCG，低劑量柚皮素優于高劑量柚皮素，橙皮苷與EGCG組合物優于柚皮素與EGCG組合物，Cx43表達上升有利于腸道上ICC細胞信號更好地傳播到平滑肌上，使得腸道狀態更加穩定，腸道內容物更快速排出，減輕便秘癥狀，如圖6所示。

圖6 不同功效成分組合物對于Cx43 mRNA的影響

2.7 Arp2/3的免疫組化結果

如圖7所示，光鏡下觀察肌動蛋白（Arp2/3）呈棕黃色，在黏膜各肌層均有Arp2/3的分布。模型組Arp2/3分布與空白對照組相比，數目減少，分布不規則。高劑量柚皮素（HN組）、低劑量EGCG（LE組）、低劑量橙皮苷與EGCG（EH組）的Arp2/3數目、分布與空白對照組相似，說明這幾組功效成分組合物可以恢復受損平滑肌，增強腸道蠕動，緩解便秘問題。

圖7 不同功效成分組合物對于Arp2/3的影響

3 結論

我國便秘人群眾多，特別是隨著老齡化加劇，老年人口便秘問題尤為突出，增加了社會負擔[14]。多數通便藥物具有不良反應，而植物食品來源的通便成分更安全、可靠，因此開展相關的研究顯得尤為迫切[15]。

便秘的產生深層機制與Cajal細胞數量降低，相關神經遞質、營養因子水平下降，平滑肌受損等有關[16-17]。已知Cajal細胞是腸道蠕動的起搏器，與平滑肌共同推動內容物蠕動，相關的神經網絡會對Cajal細胞進行調節，神經網絡異常也會使得蠕動減慢。多數研究表明，在便秘人群與便秘動物模型上，可以直觀看到Cajal間質細胞數量降低[18]，c-Kit與SCF表達的減少[19]，腸道蠕動減慢[20]。神經調節方面，便秘群體中會出現神經興奮遞質、神經營養因子降低的現象。神經營養因子對于Cajal間質細胞產生是必不可少的，同時BDNF能夠通過激活TrkB.PLC/IP3信號通路[21]，改變腸神經支配結構以及平滑肌的繼發損傷，進而調節腸道動力，緩解便秘[22]。GDNF的增多能促進受損的胃腸道的修復，緩解便秘[23-24]。通過老年便秘模型大鼠觀察到，連接蛋白Cx43表達下降，ICC與平滑肌之間的連接穩定性受損[25]。平滑肌的收縮功能下降也是便秘問題產生原因之一[26]。

試驗中便秘大鼠口服EGCG、柚皮素后，與模型組相比結腸組織中c-Kit、SCF轉錄顯著提高，提示Cajal細胞功能得到改善，這將有利于腸道電節律的產生，加強Cajal細胞與神經系統、平滑肌更好的相互協同作用。Cajal細胞改善伴隨著胃動素受體增多，腸道推進率加快，有利于從根本上增強腸道活動能力，使得腸道蠕動增強。提升c-Kit、SCF表達上，柚皮素強于EGCG，同時橙皮苷與EGCG聯用也具備改善效果，說明EGCG、柚皮素、橙皮苷可以修復腸道Cajal細胞功能，從而促進腸道轉運，減輕便秘癥狀。Yin等[27]研究結果也顯示柚皮素能夠提升便秘小鼠結腸上c-Kit、SCF表達上調，與試驗結果相符。GDNF來源于腸神經膠質細胞（Enteric Glial Cell，EGCs），EGCs在腸神經系統中含量最多，能調節胃腸神經活動，EGCs通過GDNF的位置發揮銜接腸道各個細胞之間的作用，從而達到維持腸道黏膜完整性的功能，因此GDNF的表達增加有利于腸神經系統損傷修復、保護腸道黏膜屏障功能，緩解便秘。腦腸軸研究中發現BDNF除了參與神經系統發育，還參與調節胃腸道動力。在BDNF基因敲除小鼠模型中，表現出腸道動力明顯下降。BDNF可通過TRKB-PLC-Ca2+信號通路調節腸道動力，同時增強5-HT、Ach釋放，促進平滑肌收縮[28]。GDNF、BDNFmRNA上調表明EGCG、柚皮素、橙皮苷可通過神經系統調節，改善便秘大鼠腸道功能，加快內容物傳輸。

試驗中高、低劑量的EGCG均能提高Ach水平，表明腸道內的調控得到加強，有利于腸道運動。Zhang等[29]研究也發現EGCG能夠提高大鼠Ach水平，加快腸道運輸，與試驗結果相符。

在EGCG、柚皮素處理之后，連接蛋白Cx43的水平顯著提高，低劑量的EGCG、柚皮素優于高劑量，橙皮苷與EGCG聯用效果優于單獨使用EGCG，表明橙皮苷具備調節連接蛋白Cx43功能。結果表示EGCG、柚皮素、橙皮苷使得ICC與平滑肌之間的穩定性提高，Cx43作為ICC細胞與平滑肌的信息通道，該蛋白的表達增加有利于電生理信號更加順利產生并傳遞至消化道平滑肌，從而使得腸道整體運動功能提升，推動物質轉運。免疫組化試驗結果說明，EGCG、柚皮素能夠通過增加肌動蛋白（Arp2/3）的表達，平滑肌的收縮能力加強，加快腸道蠕動。試驗中，與模型組相比，通過不同劑量柚皮素、EGCG之間的比較可知，低劑量柚皮素和EGCG腸道恢復及緩解便秘效果更好。

結果表明EGCG、柚皮素能夠提升Cajal間質細胞標志蛋白c-Kit和SCF的轉錄表達，顯著增加GDNF、BDNF、Ach，改善ICC與平滑肌之間受損問題，增加肌動蛋白（Arp2/3）的表達，EGCG、柚皮素通過以上機制改善大鼠便秘。EGCG與柚皮素組合、EGCG與橙皮苷組合2種組合方式也能通上述機制改善便秘。便秘問題是一個多因素相互作用形成的問題，通過調整單一的層面不能很好達到徹底解決便秘的目的。蒽醌類的植物性瀉劑（如大黃、弗朗鼠李皮、番瀉葉、蘆薈等）、酚酞等主要通過刺激結腸黏膜中的感覺神經末梢，增強結腸動力，并刺激腸道分泌，從而促進排便，但是長期服用蒽醌類植物性瀉劑會導致腸神經損害、結腸黑變病等問題[30]。試驗更進一步探究EGCG與柚皮素、橙皮苷解決便秘的多條路徑，可為相關通便機制研究提供參考。

綜上所述，EGCG、柚皮素、橙皮苷通過調節GDNF、BDNF、Ach、c-Kit、SCF、肌動蛋白（Arp2/3）的表達，提升神經-ICC-平滑肌整體的穩定性，從而發揮通便作用。試驗結果為黃茶、陳皮在健康食品中的應用提供科學依據。