透明質酸鈉組合物對小鼠潰瘍性結腸炎的緩解作用

張霞，宋永民，馮曉毅，郭學平*

華熙生物科技股份有限公司（濟南 250014）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種以慢性間歇性腸道炎癥為特征的炎癥性消化系統疾病，其可因環境因素、遺傳易感性、腸道上皮屏障功能損傷或腸道菌群的免疫反應受損而惡化[1]。潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是IBD的主要類別之一，其主要癥狀為嘔吐、腹瀉、腹痛、直腸出血以及體重減輕等，嚴重降低了UC患者的生活質量[2]。目前，UC主要是通過5-氨基水楊酸鹽、免疫抑制劑、糖皮質激素和生物制劑等藥物治療，然而藥物治療會表現出一些副作用，如過敏反應、藥物依賴性和肝毒性[3]。因此，在不損害個人生活質量的情況下預防和控制UC的替代和補充療法受到了人們的重視和青睞。其中，采用溫和、功效持久穩定、無副作用或副作用很小的天然活性物質緩解UC癥狀的治療方法也越來越受到人們的關注。

透明質酸（hyaluronic acid，HA）是一種線性糖胺聚糖，由重復的N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸雙糖單位組成[4]。國家衛健委批準的HA用于普通食品的形式為其鈉鹽，即透明質酸鈉（sodium hyaluronate，SH）。HA是構成細胞外基質的重要成分，主要在大部分軟結締組織中起著重要的生理功能，包括腸道。有研究表明，HA可以維持腸道通透性，增強腸道免疫力，減少腸道感染[5]。Mao等[6]研究發現補充外源性透明質酸增加了小鼠對葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）的耐藥性，并能夠減輕腸道炎癥狀。從而，通過口服HA改善UC成為值得關注的一種手段。

文章通過構建小鼠潰瘍性結腸炎模型，考察SH分別與乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）、菊粉（inulin，INU）及維生素C（vitamin C，VC）復配對腸道的保護功效，為以HA為主要天然活性物質緩解UC的治療方式提供應用基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物和試劑

SPF級C 57 BL/6 J小鼠（濟南朋悅實驗動物繁育有限公司），生產許可證號：SCXK（魯）20190003，動物使用許可證號：SYXK（魯）20180031，雄性，1～2月齡，體重約20±5 g，動物合格證號：NO.370726221100437887。動物飼養和處理遵循中國實驗動物科學協會實驗動物福利和倫理委員會規定。動物飼養室溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。

透明質酸鈉（分子量：2 190 kDa，華熙生物科技股份有限公司）；乳清分離蛋白（杭州科田生物技術有限公司）；菊粉（廣東雅惠生物科技有限公司）；維生素C（河南天得商貿有限公司）；葡聚糖硫酸鈉（分子量：4萬，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；HE染色劑（珠海貝索生物技術有限公司）；甲醛水溶液和石蠟（江蘇世泰實驗器材有限公司）。

1.1.2 儀器和設備

UW 2200 H型電子天平（日本島津公司）；Tissue-Tek?PrismaTM型全封閉組織脫水機（日本櫻花公司）；TK-218型攤烤片機（湖北泰維醫療器械有限公司）；NP-B型生物組織包埋機（湖北諾普醫療器械有限公司）；RM 2235型切片機（德國Leica公司）；尼康E 100生物顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組及模型的構建

健康雄性C 57 BL/6 J小鼠，SPF級，20±5 g，50只，按體重將其隨機分為5組：空白對照組（Control）、模型組（DSS）、SH+乳清分離蛋白組（SH+WPI），SH+菊粉組（SH+INU），SH+維生素C組（SH+VC），每組10只。

空白對照組的小鼠在28 d期間都飲用純水。模型組小鼠在28 d內用純水灌胃，在第22～第28天期間飲用含質量分數為2.50% DSS的純水溶液，用以建立潰瘍性結腸炎小鼠模型；其他SH組合物組小鼠在28 d內灌胃相應同體積的供試品溶液，在第22～第28天飲用含質量分數2.50% DSS的純水溶液。各試驗組的灌胃劑量及質量濃度見表1，按照0.20 mL/10 g體積給小鼠進行灌胃。透明質酸鈉的用量為人體推薦攝入量200 mg/d的10倍。

除空白對照組外，各個試驗組在22～28 d間，每2 d更換1次DSS溶液。在試驗第28天下午全部小鼠禁食，第29天對小鼠實施安樂死。

1.2.2 疾病活動指數（disease activity index，DAI）評估

通過潰瘍性結腸炎模型建立后每天記錄的臨床癥狀表現進行腸道疾病活動指數評估。體重減輕（0：無；1：減少1%～5%；2：減少5%～10%；3：減少10%～15%；4：減少＞15%）、大便稠度（0：正常；2：稀便；4：水樣腹瀉）和血便情況（0：正常；2：輕微出血；4：嚴重出血）三項的總和，作為腸道疾病活動指數的衡量標準。

1.2.3 結腸長度測定

試驗結束后，對小鼠進行安樂死處理，迅速剖開腹腔，分離小鼠結腸，測量盲腸末端至肛門整個腸段的長度。

1.2.4 結腸組織病理學檢測

取距肛門處2 cm的結腸組織，置于質量分數10%中性甲醛溶液浸泡固定，常規石蠟包埋切片，進行HE染色，最后通過光學顯微鏡觀察腸黏膜的病理變化，并進行組織病理學評分。隱窩結構的破壞（0～4：無損傷、基底三分之一損傷、基底三分之二損傷、僅表面上皮完整、整個隱窩和整個上皮丟失）、病變深度（0～3：無、黏膜、黏膜下、透壁）和炎癥細胞浸潤的程度（0～3：無、輕微、中度、嚴重）三項的總和，作為組織病理學評分。

1.3 統計分析

文章數據均以表示，使用SPSS 16.0軟件進行統計分析。計量資料采用單因素方差分析（ANOVA）或T檢驗，評分資料采用秩和檢驗（Mann-WhitneyU檢驗）。所有圖均采用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 SH組合物對潰瘍性結腸炎小鼠DAI值的影響

DAI評分是UC模型建立成功的標準之一。參照試驗記錄，空白對照組小鼠體重變化輕微，精神狀態及活動量正常，而其他各組小鼠在給予DSS后逐漸出現體重減輕、精神不振、活動量下降、腹瀉等現象。這種現象與孫晶晶等[7]的研究中描述一致。從圖1可以看出，小鼠以質量分數2.50% DSS溶液自由飲用期間，與空白對照組相比，模型組小鼠DAI評分顯著升高（P＜0.05），表明小鼠潰瘍性結腸炎模型形成。與模型組相比，經SH+WPI、SH+INU和SH+VC干預后，小鼠DAI評分分別降低了26.42%，35.85%和33.96%，說明三組SH組合物具有減輕由DSS引起的潰瘍性結腸炎癥狀的趨勢。

2.2 SH組合物對潰瘍性結腸炎小鼠結腸長度的影響

小鼠結腸萎縮是UC的重要特征之一[8]。從圖2可以看出，與空白對照組相比，DSS組的結腸長度萎縮了1.15 cm（P＜0.05），說明小鼠UC模型建立成功。同時，經SH+WPI、SH+INU干預后，小鼠結腸長度分別縮短了0.52 cm、0.14 cm，而SH+VC組的結腸更長，增加了0.51 cm，腸內容物為健康的黑色狀態，說明口服這三種SH組合物能顯著抑制小鼠結腸長度縮短（P＜0.05），有效改善UC的結腸萎縮。吳銘等[9]的研究中，經紫色菜蔬乙醇提取物干預后的小鼠結腸長度較模型組小鼠顯著增長，得出其能夠有效抑制DSS導致結腸炎小鼠結腸萎縮情況的結論，該試驗結論與文章研究類似。

圖2 SH組合物對結腸炎小鼠結腸長度的影響

2.3 SH組合物對潰瘍性結腸炎小鼠腸道組織病理的影響

腸道組織學改變和結腸黏膜損傷是UC的病理表現特征[10]。從圖3可以看出，空白對照組小鼠的結腸黏膜杯狀細胞及腺體隱窩結構完整，且排列整齊，沒有炎性細胞浸潤，而模型組小鼠結腸黏膜杯狀細胞丟失，腺體隱窩結構破壞，伴有炎性細胞浸潤。這與Lü等[11]用DSS對小鼠構建UC模型后的結腸組織病理學變化一致。SH+INU組、SH+VC組小鼠的結腸黏膜損傷有一定程度減輕，腺體隱窩排列趨于整齊，上皮結構較完整，炎性細胞浸潤減少。同時，根據圖4小鼠結腸組織病理學評分，對比模型組，SH+INU組小鼠結腸病理評分降低了43.18%，SH+VC組小鼠結腸病理評分降低38.64%（P＜0.05）。病理結果表明，SH+INU具有改善小鼠結腸組織損傷的趨勢，SH+VC可明顯改善DSS誘導的小鼠結腸組織損傷。

圖3 各組小鼠結腸組織HE染色

3 討論

潰瘍性結腸炎因其慢性、復發、高發病率等特性，已成為世界范圍內主要的健康問題之一[12]。患有潰瘍性結腸炎的人，其免疫反應被激活，腸道通透性增加，腸道黏膜屏障結構及腸道微生物群的穩態被破壞，從而激活更嚴重的免疫反應，導致疾病復發[13]。透明質酸是一種糖胺聚糖聚合物，已被證明在胃腸道的穩態中發揮重要作用。透明質酸在腸道炎癥疾病中具有抗炎和富集微生物的作用[14]。同時，有研究表明透明質酸主要通過維持腸道屏障防御和功能來預防腸道細菌感染和減少腸道炎癥[5,15-18]。菊粉是一種天然果聚糖，其作為益生元可以改善腸道中菌群的結構與組成，以及加強腸黏膜屏障作用，從而發揮對炎癥性腸病的有效影響[19]。乳清蛋白為常見蛋白補充劑之一，其主要組成成分為免疫球蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等。乳清蛋白含有蛋氨酸與半胱氨酸，能夠抑制機體的氧化應激以及改善腸道中致病菌群的相對豐度，最終發揮保護腸道屏障的功能[20]。維生素C具有強大的氧自由基清除能力，其能夠通過抑制炎癥細胞浸潤，調節炎癥因子等多種途徑抑制炎癥反應[21]。同時，維生素C可以增強腸道黏膜的屏障功能[22]。

基于此，文章將透明質酸鈉分別與菊粉、乳清分離蛋白、維生素C進行復配，研究不同SH組合物對潰瘍性結腸炎的緩解作用。文章采用質量分數2.50%DSS溶液對小鼠造成潰瘍性結腸炎模型，與模型組對比，各SH組合物組小鼠的DAI值增長緩慢，結腸長度均顯著延長（P＜0.05），同時，SH+INU、SH+VC組小鼠的結腸黏膜損傷有一定程度減輕，腺體隱窩排列較整齊，上皮結構較完整，炎性細胞浸潤減少，且SH+VC組小鼠結腸病理評分顯著降低（P＜0.05）。

4 結論

綜上所述：透明質酸鈉分別與乳清分離蛋白、菊粉、維生素C復配均可發揮對小鼠潰瘍性結腸炎的緩解作用，其中，透明質酸鈉與維生素C復配的效果更為明顯。此研究結果為透明質酸鈉及其組合物在緩解潰瘍性結腸炎方面的應用提供了理論依據。