HPLC法測定食品中脫氫乙酸含量的方法優化

范靈慧

上海源本食品質量檢驗有限公司（上海 200090）

脫氫乙酸，固態為白色或略微淡黃色具有結晶性的顆粒狀粉末，無臭、沒有任何氣味、熔點108～110℃，沸點270 ℃，是一種具有低毒、高效的防腐、防霉劑。在酸、堿等環境下具有一定的抗菌功能，特別是對霉菌的抑制作用最強[1]。它通常是一種有效的消毒劑。但是過量服用會對身體產生一定的危害。我國允許在部分食品中添加使用。GB 5009.121—2016《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》中脫氫乙酸的液相色譜法前處理過程較為復雜，不同基質處理方法不同，進樣后色譜峰拖尾嚴重，此次試驗在國標基礎上進行簡化，優化流動相比例和不同基質的前處理方法，使實驗操作更簡單且峰型更對稱。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜儀Ultimate3000（賽默飛世爾科技有限公司）；電子天平BSA 423S（德國賽多利斯公司）；超聲波清洗器FXP 20M（Unisonics Australia）；渦旋震蕩混合器BE-2600（其林貝爾儀器制造有限公司）；實驗室pH計FE20[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

乙酸銨[默克化工技術（上海）有限公司]；氫氧化鈉（永華化學股份有限公司）；硫酸鋅（上海凌峰化學試劑有限公司）；甲醇（色譜純，美國默克公司）；氨水（永華化學股份有限公司）；超純水（上海和泰儀器有限公司實驗室超純水機制得）；0.45 μm水相濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）；脫氫乙酸（dehydroacetic acid）標準品（BePure，純度大于99.9%）。

標準儲備液：準確稱取0.050 g脫氫乙酸標準品，用20 g/L的氫氧化鈉溶液溶解后用水定容至50 mL，配制成質量濃度1.0 mg/mL的標準儲備液。

標準工作液：標準儲備液經逐級稀釋后，配制成1，10.0，50.0，100和200 μg/mL標準工作液質量濃度。檢測用食品：市場流通渠道購買。

1.2 儀器工作條件

色譜柱DikMA Silversil 5 μm C18，250 mm×4.6 mm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；流速1.0 mL/min；檢測波長293 nm；進樣時間22 min；流動相為乙酸銨溶液（0.02 mol/L）-甲醇，洗脫比例見表1。

表1 脫氫乙酸流動相梯度洗脫比例

1.3 樣品前處理

稱取2 g試樣于50 mL玻璃比色管中，加入25 mL超純水，旋渦混合1 min，超聲提取30 min以上，取出后再次渦旋混合1 min，加入5 mL的ZnSO4溶液（120 g/L），用NaOH溶液（20 g/L）調節pH 7.5，用水定容至50 mL，搖勻，用濾紙過濾，取澄清濾液，過0.45 μm的水相濾膜后上機測定。

2 結果與討論

2.1 前處理中蛋白沉淀劑的選擇

分別對常用的無機沉淀蛋白體系，即亞鐵氰化鉀和乙酸鋅、亞鐵氰化鉀和硫酸鋅、氫氧化鈉和硫酸鋅進行加標回收試驗。結果表明，在3種沉淀體系中氫氧化鈉與硫酸鋅沉淀法的回收率最高，故試驗選用氫氧化鈉和硫酸鋅作為蛋白沉淀劑。

2.2 色譜操作條件的確定

2.2.1 檢測波長的確定

使用DAD檢測器，在3D光譜圖上讀取到脫氫乙酸吸收峰最大時候的波長分別在230 nm和293 nm處，但是在230 nm處時，雜質干擾多，在293 nm處雜質干擾少，故選取檢測波長293 nm，與國標方法波長一致。

2.2.2 流動相梯度洗脫比例

脫氫乙酸抗酵母菌和霉菌的效果較好，因此被廣泛應用于面包、糕點和發酵食品中，由于這些食品中經常會同時添加各種類型的添加劑，為使樣品中性質差異較大的組分能達到良好的分離效果，以及洗脫干凈的目的，試驗采用梯度洗脫。洗脫比例見表1。

2.2.3 流動相pH的選擇

在相同的儀器條件下，對質量濃度50.0 μg/mL的脫氫乙酸標品進樣后對比圖譜。使用GB 5009.121—2016《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》中方法，0.02 mol/mL乙酸銨-甲醇9∶1（體積比）流動相進樣圖譜如圖1所示。試驗將0.02 mol/mL的乙酸銨用氨水調節pH 9.0，初始流動相比例為甲醇-0.02 mol/mL乙酸銨1∶49（體積比），并采用表1梯度洗脫，進樣圖譜如圖2所示。

圖1 0.02 mol/mL乙酸銨與甲醇9∶1（體積比）流動相進樣圖譜

圖2 用氨水調節pH的0.02 mol/mL乙酸銨與甲醇1∶49（體積比）進樣圖譜

由圖1和圖2的圖譜對比可看出，使用試驗優化后的流動相進樣，得到的脫氫乙酸色譜峰的峰型和對稱性較好。

2.3 線性關系

標準品質量濃度在1.0～200.0 mg/mL的質量濃度范圍內響應值好，峰面積的線性關系良好，線性方程y=0.482 8x，相關系數R2=0.999 7。見表2。

表2 脫氫乙酸檢出限、定量限及線性方程

2.4 回收試驗

2.4.1 國標法與試驗優化方法回收率比較

根據GB 5009.121—2016 《食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定》第二法液相色譜法中12.1試樣制備與提取可知，國標法對不同的基質有不同的前處理方式。試驗簡化后的前處理方法則可統一處理不同基質的樣品，選用果蔬汁、腐乳、糕點和黃油作為試驗基質加入脫氫乙酸標準品，分別按照國標方法和試驗方法前處理后進樣，對比它們的加標回收率，結果見表3。

表3 不同基質樣品不同前處理方法回收率

2.4.1.1 果蔬汁

按國標方法稱樣在離心管中，需要調pH后轉移到容量瓶中定容，置于離心管中離心取上清液調節pH后再次定容，取5 mL過固相萃取柱，收集洗脫液后上機測定，在該前處理過程中，反復的轉移和過固相萃取柱都會造成損失。而試驗優化后的前處理直接稱樣在比色管中，加入沉淀劑后用比色管定容即可，減少反復轉移和固相萃取柱凈化的步驟，可以提高回收率。由數據結果也可得出國標方法回收率較優化后方法低。

2.4.1.2 腐乳

按國標方法稱樣在離心管中，轉移到容量瓶中定容，超聲提取后過濾上機，回收率達99%，試驗前處理優化后回收率也達100%，在回收率相差不大的情況下，試驗的前處理過程更為簡單和方便。

2.4.1.3 糕點

按國標法稱樣溶解加入沉淀劑定容后需要轉移至分液漏斗中，用正己烷重復抽提后取水相層離心，取上清液過濾膜測定，若高效液相色譜分離效果不明顯，需要取上清液調節pH后過固相萃取柱，洗脫后再上機。從表3可知，通過國標法萃取后，回收率已較低，過固相萃取柱之后損失更大，而用試驗優化后的前處理方法，回收率較好。

2.4.1.4 黃油

根據國標法需要用正己烷抽提后離心上機，若分離效果不佳再過固相萃取柱凈化，試驗國標法回收率達103%，但是過固相萃取柱之后回收率為98%，而試驗回收率為109%，雖然操作便捷，但是試驗優化后減少去油脂的步驟，對油脂含量高的食品檢測結果影響較大，故回收效果不如國標方法。

因此，試驗優化后的前處理方法適用于大部分的基質樣品，進樣后分離度好，且回收率高。國標方法若是分離效果不明顯需要再次過固相萃取柱，造成較大損失。但當樣品為油類基質時，更推薦使用國標法。

2.4.2 方法優化后回收率與精密度

選取蔬菜汁、腐乳、糕點樣品，按定量限的3，5和10倍范圍進行加標回收，故分別在0.015 0，0.025 0和0.050 0 g/kg三水平添加脫氫乙酸，按優化的前處理方法進行提取和測定，每個添加水平平行測定6次，計算回收率和精密度。試驗結果表明，測得的平均回收率范圍為97.1%～104.0%，SRSD在0.34%～2.32%。測定結果見表4。

表4 添加回收率和精密度（n=6）

表5 糕點中的脫氫乙酸質控回收率數據

2.4.3 實物質控樣

質控樣品為糕點中的脫氫乙酸，經過試驗的前處理步驟后，上機測定值為0.259 g/kg，折算質控參考值0.265 g/kg，回收率達97.8%。按照試驗方法檢測結果為滿意，數據結果證實方法的準確性好。

3 結論

試驗針對食品中脫氫乙酸的提取和分析條件在國標的基礎上進行優化，利用高效液相色譜儀對其進行有效的分離和測定，該方法具有較好的精密度和回收率，線性關系良好，針對不同基質也可使用同樣的前處理方法，實現不同基質樣品可同時處理，對檢測任務較重的第三方檢測可以節約大量時間成本和人力成本。