玉米粉（渣）中伏馬菌素膠體金快檢產(chǎn)品評(píng)價(jià)與應(yīng)用

傅駿青，程玲云，楊振東，于艷艷，楊穎，胡梅*

山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，產(chǎn)業(yè)技術(shù)基礎(chǔ)公共服務(wù)平臺(tái)（濟(jì)南 250101）

伏馬菌素是多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)相似的一類(lèi)雙酯化合物，是由串珠鐮刀菌、輪狀鐮刀菌等在一定溫度、濕度下產(chǎn)生的一種真菌毒素[1,3]。已發(fā)現(xiàn)的伏馬菌素包括A、B、C、P這4類(lèi)共11種，其中毒性最強(qiáng)的是伏馬菌素B1[4-5]。伏馬菌素主要污染的食物種類(lèi)為玉米及其制品，玉米粉（渣）是最常見(jiàn)的玉米制品，也是最典型的伏馬菌素污染載體[6]。

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IRAC）將伏馬菌素列為人類(lèi)潛在致癌物質(zhì)（Group 2B類(lèi)物質(zhì)）[7-8]，部分國(guó)家及地區(qū)組織制定玉米制品中伏馬菌素的限量要求，國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）規(guī)定玉米粉和玉米面中伏馬菌素B1+B2限量為2 000 μg/kg[9]。我國(guó)正在修訂的GB 2761《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》增加食品中伏馬菌素限量。

食品中伏馬菌素的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為GB 5009.240—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中伏馬毒素的測(cè)定》[10]，快檢方法為KJ 202106《玉米及其碾磨加工品中伏馬毒素的快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法》。膠體金免疫層析法作為快檢方法中最省時(shí)省力且經(jīng)濟(jì)的方法，適用于大批量樣品的初篩和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，具有不可替代性，已得到廣泛應(yīng)用[11-13]。但膠體金免疫層析法的準(zhǔn)確性依賴(lài)快檢產(chǎn)品的質(zhì)量[14-15]，進(jìn)行產(chǎn)品調(diào)研和適用性評(píng)價(jià)是必要的工作。

試驗(yàn)調(diào)研國(guó)內(nèi)市售測(cè)定玉米粉（渣）中伏馬菌素的10種膠體金定性快速檢測(cè)產(chǎn)品，分析一般性指標(biāo)的差異。選取3種主流品牌的快檢產(chǎn)品，以GB 5009.240—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中伏馬毒素的測(cè)定》[10]為參比方法，分析3種品牌快檢產(chǎn)品的適用性。選擇1種品牌對(duì)30批次玉米粉（渣）盲樣進(jìn)行應(yīng)用測(cè)定，以考察快檢產(chǎn)品的實(shí)際應(yīng)用性，為玉米粉（渣）中伏馬菌素的快速篩查工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：伏馬菌素B1（CAS號(hào)116355-83-0）、伏馬菌素B2（CAS號(hào)116355-84-1）、伏馬菌素B3（CAS號(hào)136379-59-4），質(zhì)量濃度均為50 μg/mL。

樣品基質(zhì)：為保證樣品代表性，購(gòu)買(mǎi)產(chǎn)自主要玉米產(chǎn)區(qū)山東、四川、河北、河南、廣東、遼寧、陜西的玉米粉（渣）作為盲樣。

伏馬菌素快速檢測(cè)產(chǎn)品購(gòu)自10個(gè)國(guó)內(nèi)品牌，為避免評(píng)價(jià)結(jié)果對(duì)快檢品牌的影響，10個(gè)快檢品牌分別標(biāo)記為北京A、武漢B、北京C、北京D、廣東E、深圳F、上海G、江蘇H、廣東I、山東J。

其他試劑均為分析純，符合快檢試劑盒使用要求。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC/TQD液相色譜-質(zhì)譜儀（美國(guó)沃特世公司）；MS204S電子天平（梅特勒-托利多公司）；3-18KS冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)希格瑪公司）；IKAMS3basic渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）；恒溫水浴振蕩器（金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 盲樣制備

玉米粉、玉米渣樣品用谷物粉碎機(jī)磨碎并過(guò)0.850 mm（20目）篩。按照不同快檢品牌（北京A、武漢B、北京C）的要求稱(chēng)取樣品到相應(yīng)規(guī)格的離心管中，編號(hào)后置于0～4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 加標(biāo)

取預(yù)先經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定完成的空白樣品，按照1.3.1樣品制備法制備空白樣品。由于不同品牌快檢產(chǎn)品的檢出限不同，取稱(chēng)量好的空白樣品，按照0，0.5和1.0倍檢出限分別對(duì)空白樣品各加標(biāo)10份。

1.3.3 評(píng)價(jià)方法

1.3.3.1 液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定

參比方法選擇GB 5009.240—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中伏馬菌素的測(cè)定》（第二法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法）對(duì)待測(cè)盲樣進(jìn)行伏馬菌素含量測(cè)定。

檢測(cè)條件：流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%的甲酸水溶液；流速0.30 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3.2 膠體金快檢試劑盒定性測(cè)定

為評(píng)價(jià)試驗(yàn)產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，用于分析的盲樣由陰性樣品、陽(yáng)性樣品組成。根據(jù)選定的快檢產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)，分別對(duì)2個(gè)空白樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平加標(biāo)樣品的定性檢測(cè)，每個(gè)濃度水平10次平行試驗(yàn)。

1.3.3.3 盲樣應(yīng)用驗(yàn)證

采用選定的快檢產(chǎn)品對(duì)30批次盲樣進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用測(cè)定，每個(gè)盲樣平行測(cè)定2次，同時(shí)進(jìn)行人員比對(duì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

計(jì)算試驗(yàn)所用快檢產(chǎn)品的靈敏度、特異性、假陰性率、假陽(yáng)性率，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 國(guó)內(nèi)市售伏馬菌素膠體金快檢產(chǎn)品調(diào)研情況

選擇國(guó)內(nèi)10家市售伏馬菌素膠體金定性快速檢測(cè)產(chǎn)品，分析一般性指標(biāo)差異，結(jié)果見(jiàn)表1。從測(cè)定對(duì)象看，10家快檢產(chǎn)品測(cè)定對(duì)象均包含伏馬菌素B1，僅北京A、北京C、廣東E可測(cè)定伏馬菌素B族（B1+B2+B3）。從適用基質(zhì)看，產(chǎn)品多適用于糧食、飼料，經(jīng)與品牌方溝通，10家快檢產(chǎn)品實(shí)際均可用于測(cè)定玉米粉（渣）中的伏馬菌素。從檢測(cè)限看，檢測(cè)限范圍為200～60 000 μg/kg不等，北京A、武漢B、北京D可根據(jù)基質(zhì)的不同一定范圍內(nèi)自行調(diào)整檢測(cè)限。從產(chǎn)品完整性看，除江蘇H外，其余產(chǎn)品包裝、標(biāo)簽標(biāo)注完整，江蘇H包裝缺少產(chǎn)品有效期限（限用日期）；北京A等7家產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)內(nèi)容完整；武漢B等7家產(chǎn)品試劑耗材配套齊全，上海G、廣東I、山東J缺少耗材離心管。從反應(yīng)時(shí)間看，產(chǎn)品均可在10 min內(nèi)判讀結(jié)果，反應(yīng)時(shí)間最短為3 min，最長(zhǎng)為8～10 min。從產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)性看，產(chǎn)品單價(jià)范圍在17.5～35元不等，深圳F產(chǎn)品單價(jià)最低，但檢測(cè)限過(guò)高；北京C檢測(cè)限最低，單價(jià)最高；北京A可測(cè)定伏馬菌素B族，檢測(cè)限可調(diào)，價(jià)格適中。綜合以上調(diào)研情況，選定北京A、武漢B、北京C進(jìn)行技術(shù)性指標(biāo)評(píng)價(jià)，選定北京A進(jìn)行盲樣應(yīng)用測(cè)定試驗(yàn)。

表1 國(guó)內(nèi)市售伏馬菌素產(chǎn)品一般性指標(biāo)

2.2 快檢試劑盒的適用性評(píng)價(jià)

2023年1月，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局為規(guī)范市場(chǎng)監(jiān)管部門(mén)、銷(xiāo)售食品的市場(chǎng)開(kāi)辦者使用食品快檢的行為，發(fā)布《關(guān)于規(guī)范食品快速檢測(cè)使用的意見(jiàn)》[17]，對(duì)食品快速檢測(cè)操作、信息公布、結(jié)果驗(yàn)證、產(chǎn)品符合性評(píng)價(jià)進(jìn)行規(guī)范。其中，《食品快速檢測(cè)產(chǎn)品符合性評(píng)價(jià)程序（附件4）》明確食品快檢產(chǎn)品符合性評(píng)價(jià)技術(shù)要求。參照《食品快速檢測(cè)產(chǎn)品符合性評(píng)價(jià)程序》，評(píng)估北京A、武漢B、北京C快檢試劑盒的適用性，并進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用性測(cè)定。

2.2.1 北京A試劑盒適用性評(píng)估

北京A試劑盒的檢測(cè)限為2 000～60 000 μg/kg，可通過(guò)調(diào)整樣品處理時(shí)的稀釋比例調(diào)整檢測(cè)限至2 000 μg/kg。加標(biāo)濃度為0和0.5倍檢出限時(shí)不顯色（陰性），加標(biāo)濃度為1倍檢出限時(shí)顯色（陽(yáng)性），分別進(jìn)行10次平行試驗(yàn)。計(jì)算此試劑盒的靈敏度、特異性、假陰性率和假陽(yáng)性率，結(jié)果為靈敏度100%、特異性100%、假陰性率0、假陽(yáng)性率0。試紙條顯色結(jié)果穩(wěn)定且準(zhǔn)確，對(duì)玉米粉、玉米渣基質(zhì)無(wú)差異，結(jié)果見(jiàn)表2。達(dá)到反應(yīng)時(shí)間5 min時(shí)，試紙條顯色清晰可辨。北京A試劑盒對(duì)玉米粉（渣）中伏馬菌素測(cè)定適用性良好。

表2 北京A試劑盒測(cè)定玉米粉（渣）中伏馬菌素結(jié)果

2.2.2 武漢B試劑盒適用性評(píng)估

武漢B試劑盒的檢測(cè)限為0～6 000 μg/kg，可通過(guò)調(diào)整樣品處理時(shí)的稀釋比例調(diào)整檢測(cè)限至1 000 μg/kg。加標(biāo)濃度0和0.5倍檢出限時(shí)不顯色（陰性），加標(biāo)濃度1倍檢出限時(shí)顯色（陽(yáng)性），分別進(jìn)行10次平行試驗(yàn)。計(jì)算此試劑盒的靈敏度、特異性、假陰性率和假陽(yáng)性率，結(jié)果為靈敏度90%、特異性100%、假陰性率10%、假陽(yáng)性率0。試紙條顯色結(jié)果準(zhǔn)確性稍低，對(duì)玉米粉、玉米渣基質(zhì)無(wú)差異，結(jié)果見(jiàn)表3。出現(xiàn)假陰性結(jié)果可能導(dǎo)致伏馬菌素超標(biāo)漏檢的情況，應(yīng)調(diào)整試紙條靈敏度。反應(yīng)時(shí)間3 min時(shí)，試紙條顯色基本清晰，但延長(zhǎng)至4 min時(shí)顯色完全清晰，建議延長(zhǎng)武漢B試劑盒反應(yīng)時(shí)間。武漢B試劑盒對(duì)玉米粉（渣）中伏馬菌素測(cè)定適用性較差，建議進(jìn)一步改進(jìn)工藝提升準(zhǔn)確性。

表3 武漢B試劑盒測(cè)定玉米粉（渣）中伏馬菌素結(jié)果

2.2.3 北京C試劑盒適用性評(píng)估

北京C試劑盒的檢測(cè)限為200 μg/kg，加標(biāo)濃度0和0.5倍檢出限時(shí)不顯色（陰性），加標(biāo)濃度1倍檢出限時(shí)顯色（陽(yáng)性），分別進(jìn)行10次平行試驗(yàn)。計(jì)算此試劑盒的靈敏度、特異性、假陰性率和假陽(yáng)性率，結(jié)果為靈敏度100%、特異性90%、假陰性率0、假陽(yáng)性率10%。試紙條顯色結(jié)果不穩(wěn)定，玉米渣基質(zhì)在0.5倍檢出限略不準(zhǔn)確，結(jié)果見(jiàn)表4。出現(xiàn)4批次假陽(yáng)性結(jié)果增加復(fù)檢工作量，影響工作效率，但不影響被檢產(chǎn)品的質(zhì)量安全。反應(yīng)時(shí)間8 min時(shí)，試紙條顯色清晰，可判讀結(jié)果。北京C試劑盒對(duì)玉米渣中伏馬菌素測(cè)定適用性較差，建議進(jìn)一步調(diào)整試劑盒的特異性。

表4 北京C試劑盒測(cè)定玉米粉（渣）中伏馬菌素結(jié)果

2.3 盲樣中伏馬菌素定值與應(yīng)用性測(cè)定

2.3.1 液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定

依據(jù)GB 5009.240—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中伏馬菌素的測(cè)定》第二法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法，對(duì)30批次待測(cè)盲樣進(jìn)行伏馬菌素含量定值測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。從污染水平看，25批次盲樣檢出伏馬菌素，檢出率為83.33，5批次未檢出（＜40 μg/kg）伏馬菌素。盲樣檢測(cè)平均值為998.13 μg/kg，接近歐盟限量（1 000 μg/kg）。最大值為11 635.26 μg/kg，超國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）限量（2 000 μg/kg）近5倍，為產(chǎn)自陜西的玉米粉。以CAC限量計(jì)，共發(fā)現(xiàn)4批次盲樣超限量，分別來(lái)自山東（2批次）、陜西（1批次）、遼寧（1批次）。從基質(zhì)差異看，共7批次盲樣的檢測(cè)結(jié)果超過(guò)歐盟限量，包括6批次玉米粉和1批次玉米渣。共5批次盲樣未檢出伏馬菌素，包括4批次玉米渣和1批次玉米粉，顯示玉米粉比玉米渣更容易受到伏馬菌素污染。

表5 不同方法測(cè)定盲樣中伏馬菌素結(jié)果

2.3.2 盲樣應(yīng)用測(cè)定

選擇北京A試劑盒對(duì)30批次待測(cè)盲樣進(jìn)行伏馬菌素定性測(cè)定，每個(gè)盲樣平行測(cè)定2次，同時(shí)進(jìn)行人員比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表5。樣品中伏馬菌素含量大于2 000 μg/kg時(shí)快檢試紙條顯陽(yáng)性，小于2 000 μg/kg時(shí)快檢試紙條顯陰性，試劑盒盲樣測(cè)定結(jié)果與參比方法結(jié)果一致，平行測(cè)定結(jié)果一致，人員比對(duì)結(jié)果一致。北京A試劑盒對(duì)盲樣測(cè)定應(yīng)用性良好，結(jié)果有效。

3 結(jié)論

通過(guò)調(diào)研國(guó)內(nèi)市場(chǎng)伏馬菌素快檢產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)多種快檢產(chǎn)品存在問(wèn)題。快檢產(chǎn)品可以測(cè)定的玉米粉（渣）中伏馬菌素種類(lèi)單一，所有產(chǎn)品均可測(cè)定伏馬菌素B1，僅少數(shù)產(chǎn)品可測(cè)定伏馬菌素B族；由于我國(guó)暫無(wú)食品中伏馬菌素限量要求，快檢產(chǎn)品檢測(cè)限差別大，需要根據(jù)基質(zhì)選擇檢測(cè)限合適的產(chǎn)品；部分產(chǎn)品存在基本信息標(biāo)示不全或耗材不充分的情況。

從試劑盒評(píng)價(jià)結(jié)果看：玉米粉或玉米渣基質(zhì)差異對(duì)快檢試劑盒測(cè)定無(wú)影響，北京A試劑盒顯色結(jié)果穩(wěn)定且準(zhǔn)確性高；武漢B試劑盒假陰性率為10%，可能漏檢超檢測(cè)限樣品；北京C試劑盒假陽(yáng)性率為10%，增加了復(fù)檢工作量，但不影響被檢產(chǎn)品的質(zhì)量安全。從盲樣測(cè)定結(jié)果看，玉米粉（渣）中伏馬菌素檢出率為83.33%，污染較為普遍；超CAC限量的盲樣占比13.33%，伏馬菌素污染風(fēng)險(xiǎn)較高；玉米粉比玉米渣更容易受到伏馬菌素污染。

總之，可采用膠體金快檢方法對(duì)玉米及其制品中伏馬菌素進(jìn)行初篩和日常監(jiān)控，但應(yīng)謹(jǐn)慎選擇合適的快檢產(chǎn)品。機(jī)構(gòu)或企業(yè)可參照《關(guān)于規(guī)范食品快速檢測(cè)使用的意見(jiàn)》對(duì)快檢產(chǎn)品進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，以保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。