余甘子對肥胖大鼠的安全性評價

木其爾，陳希民，張彧格，陳月曉*

1.北京市營養源研究所有限公司（北京 100069）；2.中國營養學會營養與保健食品分會（北京 100053）；3.北京城市學院生物醫藥學部（北京 100094）；4.北京市科學技術研究院生物技術與健康研究所（北京 100089）

余甘子（Phyllanthus emblica）也叫油甘子、滇橄欖、牛甘果及回甘子等，屬于大戟科葉下珠屬，是藥食兩用的傳統藥材[1]，作為一味重要的傳統民族藥被載入1974年版《云南省藥品標準》，1978年版《藏藥標準》和《中華人民共和國藥典》，被廣泛應用于我國中醫藥、民族醫藥及保健食品[2-3]。其主要用于治療感冒發熱、消化不良、慢性肝炎、高血壓、肥胖癥、熱性水腫和尿頻等[4]。余甘子含有豐富的多酚、沒食子酸、多糖等活性成分，作為抗氧化、護肝、降脂、降糖等功效物質，被廣泛應用保健食品[5-12]。

酚類是余甘子關鍵生物活性成分，其結構類型分為鞣質類、酚酸類、黃酮類，具有心血管保護、抗腫瘤、抗炎、抑制氧化應激等作用[13-15]。《本草綱目》中記載余甘子“久服輕身，延年生長”，表明古人對余甘子的降脂減肥作用已有認識。余甘子有效降低脂代謝紊亂模型大鼠和正常大鼠血中總膽固醇（TC）重增加指數，提高血中高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）占TC的比值[16]。陳曉蘭等[17]研究表明，余甘子能有效降低血中膽固醇和甘油三酯的含量，降低大鼠血中總膽固醇水平，提高高密度脂蛋白膽固醇水平，降低動物體重增加指數，起到降脂減肥的作用，余甘子中的鞣質[18-19]可顯著降低肥胖小鼠血脂及其肝臟脂肪病變程度，同時對脂肪合成酶FASN具有顯著的降低作用，表明余甘子對脂質代謝具有一定的作用。裴河歡等[20]研究發現，余甘子果粉可有效降低高膽固醇飲食家兔血清中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）及TC含量，升高其血清中HDL-C含量，余甘子可有效調節家兔的脂代謝情況，降低其體內脂質過氧化物含量，增強其機體的抗氧化功能，抑制其體內ET-1基因的表達。補充余甘子提取物[21]可改善超重肥胖人群心血管危險因素和血小板聚集。

余甘子作為藥食同源，與普通食品相比，一次攝入劑量有限，而中醫應用或者保健食品應用法規上并沒有相關規定限量要求。余甘子對肥胖的直接作用及其發揮有效作用的劑量缺乏系統研究數據[22]。因此通過肥胖動物模型試驗，探索余甘子提取物安全劑量的有效范圍，同時比較不同劑量余甘子提取物對肥胖動物模型大鼠的干預作用，為余甘子食物或藥物應用安全性提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

余甘子提取物（多酚17.33%、沒食子酸6.14%，西安三江生物工程有限公司）。

雄性SD大鼠[SPF級，實驗動物質量合格證號110324221103418647，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2020-0004，體重120±10 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司]；SD大鼠高脂飼料及普通維持飼料（北京華阜康生物科技股份有限公司）。

試驗動物飼養環境：SPF級屏障；光照12 h明暗交替；實驗室溫度20.0～26.0 ℃；相對濕度范圍40%～70%；飲用純化水，群籠飼養（每籠5只），自由攝食攝水。

動物倫理：中國疾病預防控制中心職業衛生所審理通過。

水合氯醛（南京金益柏生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及酶免指標瘦素、脂聯素、抵抗素測試盒（南京建成生物工程研究所）；RNA提取液、Water Nuclease-Free、RT First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green qPCR Master Mix（None ROX）、引物（武漢塞維爾生物科技公司）；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

METTLER TOLEDO電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KZ-Ⅲ-FP低溫研磨儀（武漢塞維爾生物科技公司）；D3024R臺式高速冷凍型微量離心機（DragonLab公司）；CFX熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）；NanoDroP2000超微量分光光度計（Thermo公司）；ELx800光吸收酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇凈安泰公司）；FBZ2001-uP-P標準試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物模型建立

動物分組：60只SD大鼠適應性喂養1周后，隨機分為2組，即空白對照組（NC）10只、肥胖組（FC）50。

劑量設置：以3 g/d作為人體劑量，PE50、PE100、PE200組分別以人體劑量的50，100和200倍作為劑量，即余甘子大鼠劑量分別為2.5，5.0和10.0 g/kg。

空白對照組大鼠全程予以普通維持飼料喂養，肥胖組以高脂飼料喂養。飼養2周后稱重，眼內眥靜脈采血，分離血清，檢測血脂（TC、TG、HDL-C、LDL-C）水平，依據體重及血脂篩選水平一致40只大鼠，隨機分為4組，模型對照組（MC）、余甘子1組（PE50）、余甘子2組（PE100）、余甘子3組（PE200），每組10只。

大鼠各試驗組按灌胃劑量20.0 mL/kg配制溶液，余甘子干預組分別給予余甘子提取物（2.5，5.0和10.0 g/kg）?？瞻讓φ战M和模型對照組給予等體積純化水；PE200組每日2次，其余各組每日1次，連續給樣6周。給樣期間，每周稱重1次，并根據體重調整給樣量。

干預6周后，各組大鼠麻醉后取血，離心分離血清凍存，用于指標檢測。解剖大鼠并取材，采集大鼠睪周脂肪、腎周脂肪，稱重記錄，而后置于-80 ℃條件下凍存，用于后續指標檢測。

1.3.2 樣本采集及指標測定

1.3.2.1 血清學指標

末次干預后，大鼠水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，按3 000 r/min離心10 min，分離血清，參考采用酶聯免疫吸附法檢測標準檢測血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、瘦素、脂聯素和抵抗素水平。

1.3.2.2 脂肪系數

大鼠解剖，采集腎睪周脂肪、腎周脂肪，稱重。計算腎周脂肪系數、睪周脂肪系數分別為腎周脂肪質量、睪周脂肪質量與大鼠體重之比。

肝臟指標檢測，采用酶聯免疫吸附法檢測肝臟TC、TG、HDL-C的水平。

1.4 數據統計方法

試驗數據采用SPSS 20.0進行統計分析，結果以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素分析，組間兩兩比較是否齊性，方差齊用LSD分析，方差不齊用Dunnett’s T3分析。統計學意義水平設定：P＜0.05表示顯著性差異，P＜0.01表示極顯著性差異，均可證明數據具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 余甘子提取物干預后動物死亡情況

以人體劑量50，100和200倍余甘子提取物干預大鼠6周，余甘子3組（PE200）組大鼠死亡1只，對照組、模型組及其他干預組大鼠無死亡情況出現。PE200組大鼠死亡原因可能因為200倍高劑量余甘子提取物對大鼠劑量超過大鼠可耐受劑量，或者余甘子提取物溶解度不足，PE200組每日需灌胃2次，頻繁操作對大鼠胃黏膜具有一定損傷作用，操作引起大鼠死亡。

2.2 余甘子提取物對體重和體脂的影響

造模后模型對照組（MC）、余甘子組的大鼠體重顯著高于正常對照組（NC）。干預第2周開始，MC組大鼠體重顯著高于MC余甘子組（P＜0.05），表明50，100和200倍人體劑量余甘子干預對大鼠肥胖具有顯著的抑制作用，見表1。對PE50、PE100和PE200進行組間比較發現，大鼠體重在各組之間無顯著差異（P＞0.05），肥胖大鼠抑制作用與不同水平的余甘子的劑量間無顯著相關。

高脂飼料喂養條件下，MC組睪周脂肪和腎周脂肪重量均顯著增加（P＜0.05），與其相比PE50、PE100和PE200干預組大鼠睪和腎周脂肪重量均顯著下降（P＜0.05），表明余甘子可有效抑制大鼠體內脂肪的蓄積。對照組、PE50、PE100和PE200干預組大鼠腎周脂肪系數和睪周脂肪系數無顯著差異，主要因在高脂飼料喂養條件下，大鼠體內脂肪重量增加的同時其體重也增加，從而未表現出脂肪系數差異。PE50、PE100和PE200組間比較結果顯示，100倍人體劑量余甘子干預后，大鼠睪和腎周脂肪質量呈現降低趨勢，這與余甘子干預后大鼠體重較低相關，見表2。

表2 余甘子提取物對大鼠脂肪系數和肝臟系數的影響 單位：g

MC組肝臟重量顯著高于NC組；PE50、PE100和PE200干預組大鼠肝臟質量和肝臟系數均顯著下降（P＜0.05），高劑量的余甘子可顯著減少脂肪在肝臟中的蓄積，見表2。

2.3 余甘子提取物對血清學指標的影響

2.3.1 TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影響

造模后，MC組大鼠血脂TC、HDL-C和LDL-C均顯著升高（P＜0.05）。余甘子干預后，TC和TG均顯著降低（P＜0.05），且隨著劑量增加呈現持續下降趨勢；余甘子對LDL-C具有降低作用，但未呈現劑量效應關系，見圖1。

圖1 余甘子提取物對大鼠血清學指標的影響

2.3.2 對血清瘦素、脂聯素、抵抗素的影響

瘦素是脂肪組織分泌的激素[23]，在血清中的含量和動物脂肪組織的大小呈正比。MC組瘦素顯著高于NC組（P＜0.05）；相比于MC組，高劑量的余甘子干預后，血清瘦素水平顯著降低（P＜0.05）。

脂聯素是脂肪細胞分泌的內源性生物活性多肽，是胰島素增敏激素[24]。MC組脂聯素顯著高于NC組（P＜0.05），脂肪增加過程中脂聯素分泌水平增加，對脂肪代謝進行調節。余甘子干預后，PE50組脂聯素顯著高于NC組，高脂飲食促進脂聯素的分泌；余甘子組與MC組無顯著差異，表明余甘子對脂聯素的調節作用較為有限。

抵抗素由脂肪細胞分泌，降低其對胰島素的敏感性[25]。MC組血清抵抗素顯著高于NC組（P＜0.05），脂肪增加過程中抵抗素分泌水平增加，對脂肪代謝進行調節。余甘子組抵抗素顯著高于NC組，但低于MC組（P＜0.05）。高脂飲食促進抵抗素的分泌，但余甘子對抵抗素分泌具有一定抑制作用，見表3。

表3 余甘子提取物對大鼠血清學的影響（）單位：mmol/L

表3 余甘子提取物對大鼠血清學的影響（）單位：mmol/L

組別瘦素脂聯素抵抗素NC1.61±0.372.94±0.565.52±0.83 MC2.96±0.52a3.54±0.60a9.32±0.65a PE502.07±0.72b3.73±0.52a7.99±1.56ab PE1002.58±0.89a3.27±0.577.84±1.55ab PE2002.21±0.79b3.47±0.867.54±1.25abimages/BZ_339_1358_941_2138_980.png

表4 余甘子提取物對大鼠肝臟內MDA、SOD、ALT、AST、AKP的影響

2.4 余甘子提取物對各組大鼠肝臟指標的影響

2.4.1 對肝臟內MDA、SOD、ALT、AST、AKP的影響

丙二醛MDA為脂質過氧化的最終產物，MC組肝臟MDA顯著高于NC組（P＜0.05），高脂飲食促進肝臟脂質過氧化反應。高劑量余甘子干預后，大鼠MDA顯著降低，SOD顯著增高（P＜0.05），余甘子通過促進SOD合成作用，清除或抑制脂肪過氧化。組間比較發現，PE200組MDA水平最低，SOD水平最高。

谷丙轉氨酶ALT是急性肝細胞損傷的敏感標志，谷草轉氨酶AST與堿性磷酸酶APE升高則提示肝臟實質廣泛損傷[26]。結果表明，與MC組比較，余甘子干預后肝臟AST和APE水平均降低，尤其是ALT水平顯著降低（P＜0.05），余甘子提取物對脂肪蓄積或脂質過氧化引起的肝臟損傷均有保護作用。

2.4.2 余甘子提取物對肝臟內TC、TG、LDL-C水平的影響

肝臟脂質含量檢測結果表明，MC組大鼠TC和TG顯著升高（P＜0.05），與MC組比較，余甘子組TC、TG及LDL-C均顯著降低（P＜0.05），余甘子具有降低肝臟脂質的作用。組間比較結果顯示，PE50、PE100和PE200組大鼠肝臟脂質無差異，見圖2。

圖2 余甘子提取物對肝臟TC、TG、LDL-C水平的影響

3 結論

通過肥胖動物模型試驗，探索余甘子對肥胖大鼠的安全性評價。對血清及肝臟指標檢測，未發現其對機體的毒害作用，表明最高200倍人體劑量屬于動物安全劑量。50，100和200倍人體劑量余甘子干預對大鼠肥胖具有顯著的抑制作用，不同干預劑量之間無顯著差異。余甘子干預后大鼠體重和血脂均呈現降低，血清及肝臟指標均具有明顯改善，說明余甘子具有減重作用，而且不同劑量減肥效果一致。