iNOS在老年NSCLC患者中表達及其與患者臨床病理特征和預后的關系

徐佳 孫平 王海燕 張云霞

(杭州市第三人民醫院 1呼吸內科,浙江 杭州 310009;2外科)

肺癌是常見的惡性腫瘤,隨著環境污染、生活方式改變及老齡化加劇,其患病率在我國呈上升趨勢,嚴重影響人們身心健康〔1,2〕。據統計表明,非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌總數80%以上,在全球范圍內具有較高的發病率和病死率,不僅影響患者生存質量,且威脅患者生命健康〔3〕。NSCLC作為最常見的肺癌組織學類型,具有腫瘤生長速度快的特點,且腫瘤細胞容易從原發部位擴散及轉移至遠隔器官,從而造成患者預后不佳〔4,5〕。大部分NSCLC由于癥狀較為隱匿,導致患者確診時病情已處于中晚期〔6〕。故而,尋找新的分子標志對NSCLC高危人群進行有效識別,深入了解NSCLC的生物學機制,對NSCLC患者的治療及預后改善具有重要意義。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)可催化合成一氧化氮,在多種惡性腫瘤中異常表達,且與其預后密切相關。目前,關于iNOS在NSCLC患者中表達研究甚少,缺乏可靠的臨床參考價值。本研究旨在探討iNOS在老年NSCLC患者中表達及其與臨床病理特征和預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇杭州市第三人民醫院于2018年1月至2019年1月行手術切除的老年NSCLC患者100例,取患者癌組織及其癌旁正常組織;年齡65～83歲,平均(74.32±6.28)歲。納入標準：(1)依據《中國臨床腫瘤學會(CSCO)原發性肺癌診療指南(2018版)》〔7〕標準;(2)經術后病理學證實為NSCLC;(3)具備完整的臨床和隨訪資料。排除標準：(1)伴其他部位惡性腫瘤者;(2)伴重要臟器衰竭,如嚴重呼吸道疾病、腎病、肝病或無法控制的糖尿病、高血壓等慢性疾病者;(3)術前接受過放化療者;(4)精神疾病者。

1.2免疫組化法測定iNOS蛋白表達 采用免疫組織化學法測定iNOS蛋白表達。鼠抗人iNOS多克隆抗體(英國Abcam公司),SP免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。具體方法：標本均經中性甲醛固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,連續切片4 μm。經60 ℃烤片切片30 min,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,采用3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶,抗原采用檸檬酸鈉緩沖液煮沸修復,放于室溫環境下自然冷卻。再以5%山羊血清室溫封閉30 min,滴加iNOS蛋白一抗,4 ℃孵育過夜。再滴加辣根過氧化物酶標記的二抗,放置于37 ℃孵育20 min。采用DAB顯色,自來水沖洗,蘇木素復染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,顯微鏡下觀察。

1.3結果判定 每張切片隨機選取200倍不重疊視野5個,計數陽性細胞數和細胞總數,統計陽性細胞比例。iNOS蛋白定位于細胞核,主要呈淺黃色至棕黃色顆粒狀。按照陽性細胞比例和染色強度評分乘積綜合評價。陽性細胞比例：0分為無陽性細胞;1分為陽性細胞≤10%;2分為陽性細胞11%～30%;3分為陽性細胞31%～50%;4分為陽性細胞>50%。染色強度：0分為陽性細胞無著色;1分為陽性細胞淺黃色;2分為陽性細胞棕黃色;3分為陽性細胞棕褐色。以總分≤3分表示(-),4～6分表示(+),7～9分表示(),≥10分表示()。

1.4隨訪情況 隨訪至2023年1月31日,通過查閱醫院病案記錄、電話、微信及門診等方式進行隨訪,記錄患者總生存期(OS)。

1.5統計學處理 采用SPSS25.0軟件進行t、χ2檢驗,繪制生存曲線并行多因素Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1癌組織與癌旁組織iNOS陽性表達比較 癌組織iNOS陽性表達〔65例(65.00%)〕顯著高于癌旁組織〔17例(17.00%);χ2=47.623,P<0.05〕。

2.2不同病理特征iNOS陽性表達比較 不同性別、吸煙史、腫瘤直徑、組織學分化iNOS陽性表達差異無統計學意義(P>0.05);Ⅲ～Ⅳ期iNOS陽性表達顯著高于Ⅰ～Ⅱ期,有淋巴結轉移iNOS陽性表達顯著高于無淋巴結轉移(P<0.05),見表1。

2.3NSCLC患者iNOS表達與預后關系 隨訪至2023年1月31日,隨訪時間19～60個月。NSCLC患者iNOS陽性表達OS時間(30個月)顯著短于iNOS陰性表達(39個月,P<0.05),見圖1。

圖1 NSCLC患者iNOS表達與預后關系

2.4多因素Logistic回歸分析影響預后獨立危險因素 Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移和iNOS陽性表達為影響預后獨立危險因素(P<0.05),見表2。

表2 多因素Logistic回歸分析影響NSCLC患者預后獨立危險因素

3 討 論

目前,關于NSCLC具體發病機制尚未完全闡明,而NSCLC的侵襲性轉移是導致患者最主要死亡原因,且是當今NSCLC治療的重要與難點〔7～9〕。現階段,針對NSCLC尚無特效的治療手段,且患者5年生存率較低〔10～12〕。因此,早期診斷和治療NSCLC患者是提高生存率的關鍵〔13,14〕。

近年來研究發現,肺內的巨噬細胞存在兩種類型,其中M1型巨噬細胞呈iNOS陽性,而argenase 1呈陰性;其能夠被脂多糖、腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ激活,從而產生炎性介質白細胞介素-12、一氧化氮和iNOS,其中一氧化氮能夠與過氧化物結合,從而形成一種細胞毒性過氧亞硝酸鹽〔15〕。iNOS在正常生理條件下幾乎不表達,而在病理狀態下及在誘導因素如脂多糖、白細胞介素等細胞因子誘導下,使iNOS誘導合成一氧化氮相比于正常生理條件下的一氧化氮濃度高1 000倍左右,且認為iNOS誘導生成的一氧化氮可能在腫瘤發生、發展中具有重要促進作用。近年來,研究顯示iNOS在多種腫瘤中異常表達,且認為iNOS對多種惡性腫瘤的血管生成、侵襲及生長具有一定影響〔16,17〕。王光輝等〔18〕研究表明,收集148例不同乳腺病理組織及正常乳腺組織20例,其中iNOS在乳腺正常組織中無陽性表達;而在浸潤性乳腺癌組織中陽性率為78.8%,在原位癌組織中陽性率為52.5%,在乳腺不典型增生組織中陽性率為25.0%,且存在顯著差異;5年無病生存率,原位癌中iNOS染色陽性低于陰性,可見在乳腺癌早期階段iNOS即表達出現升高,其可作為乳腺癌早期診斷及評估預后的一種潛在指標。王莉等〔19〕研究表明,iNOS在宮頸癌組織中呈過表達,且與淋巴結轉移密切相關,認為可作為宮頸癌生物學行為及預后評估的指標。趙娜等〔20〕研究表明,收集行手術切除的卵巢上皮性腫瘤及正常卵巢組織96例患者臨床資料,惡性腫瘤患者中iNOS陽性表達率高于交界性腫瘤患者、良性腫瘤患者及正常卵巢組織患者,且惡性腫瘤患者中不同臨床分期和病理分級間iNOS蛋白表達具有顯著差異,且分期越高iNOS蛋白陽性率越高,可見卵巢上皮性腫瘤患者中iNOS蛋白呈高表達,認為其可成為基因治療的靶點,對卵巢上皮性腫瘤患者發生、發展及預后具有預測作用。