電針刺激ST-36通過mSCF/c-Kit信號促進糖尿病小鼠胃組織ICC表達

周明東 田陸高 仝巧云

(三峽大學 1第一臨床醫學院,湖北 宜昌 443000;2消化疾病研究所;3宜昌市中心人民醫院消化內科)

糖尿病(DM)胃輕癱是DM患者最常見的一種并發癥,主要是因為DM患者長期血糖控制欠佳,引起胃排空明顯延遲,進而產生腹痛、腹脹、惡心和嘔吐等消化道癥狀,嚴重影響患者的生活質量〔1〕。DM胃輕癱具有較高的發病率,藥物治療目前仍是其主要的治療手段,但因長期口服藥物治療副作用明顯,且長期口服藥物后期療效欠佳,具有一定的局限性〔2〕。電針刺激是在我國傳統醫學針灸的基礎上給予一定頻率和強度的電流,以達到更有效的治療作用;具有無創、方便、廉價、可重復性強、副作用小及療效顯著等特點,得到了世界衛生組織和美國國立衛生研究院的認可〔3,4〕。研究發現電針刺激可以調節胃腸動力,改善患者消化不良的臨床癥狀,但其具體機制尚不明確〔5〕。Cajal間質細胞(ICC)是胃腸道蠕動的起搏細胞,主要以網狀形態銜接在胃腸神經末梢和平滑肌之間,是胃腸運動的始動者和神經信號傳遞者〔6〕。臨床研究表明,DM胃輕癱患者可出現明顯ICC減少,動物研究表明電針刺激可以修復ICC網絡〔7,8〕。在DM狀態下,膜型的干細胞因子(mSCF)可以促進c-Kit的表達〔9〕。本研究擬探索電針刺激是否通過mSCF/c-Kit信號促進ICC網絡修復,促進DM小鼠胃排空。

1 材料和方法

1.1動物模型構建 6～8周齡雄性C57BL/6小鼠40只,體質量20～25 g,飼養于三峽大學實驗動物中心。適宜的實驗室飼養條件下(22 ℃,12/12 h晝夜交替),可以自由進食和飲水。將小鼠隨機分為4組,正常對照(Control)組、DM(DM)組、DM假性刺激(DM+SEA)組、DM電針刺激(DM+EA)組。DM組及DM+EA組小鼠通過腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ,150 mg/kg)構建DM小鼠模型,STZ注射1 w后不同時間檢測兩次小鼠尾靜脈血糖水平,血糖水平>250 mg/dl確定為DM模型建立成功。DM+SEA組僅給予針刺(不通電流)30 min/d,DM+EA組給予10 Hz,1～3 mA,30 min/d電針刺激處理。電針刺激均于每天上午9∶00～9∶30執行。電針刺激儀為G6805-2A型(上海華誼醫用儀器有限公司),針灸針長約7 mm(北京中研太和)。小鼠足三里穴(ST-36)位于脛骨和腓骨之間,脛骨前結節下約2 mm處,垂直針刺深度2～3 mm。連續刺激8 w,定期監測小鼠體質量和血糖變化。

1.2胃排空率測定 將0.3 ml濃度為0.05%酚紅(稀釋于1.5%羥甲基纖維素鈉溶液)灌入禁食24 h后的小鼠胃中,20 min后脫頸處死小鼠,剖腹結扎賁門和幽門,取出整個胃,并將胃內容物全部取出,置于一定量的0.1 mol/L NaOH溶液中攪拌均勻,采用分光光度計檢測分析。計算胃排空率,計算公式為：胃排空率=(1-實際測定酚紅吸收光度值/標準酚紅吸收光度值)×100%。

1.3免疫熒光檢測 將獲取的新鮮胃組織置入預冷的Kreb液,沿小彎剪開胃組織,并將胃內容物清洗干凈。胃組織展開后固定在鼠尾膠原表面,采用顯微鑷去除黏膜層,冷丙酮固定10 min。將丙酮處理后胃肌層組織在1×磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次后,置入含0.3% Triton X-100的5%山羊血清封閉2 h。將封閉后的胃肌層組織在4 ℃條件下置入含0.3% Triton X-100的Ano1一抗(兔來源,1∶100;eBioscience,San Diego,CA,USA)或c-Kit一抗(大鼠來源,1∶200,Abcam,Cambridge,MA,USA)孵育24 h。PBS漂洗3次后,分別采用含0.3% Triton X-100的山羊抗大鼠Dylight 488免疫球蛋白(Ig)G和山羊抗兔Dylight 594 IgG (Abbkine) 孵育2 h。制片后采用共聚焦顯微鏡(Olymplus,東京,日本)進行檢測。

1.4Western印跡檢測 將新鮮冰凍胃組織研磨后加入裂解液,提取組織蛋白,并采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。每個樣本吸取80 mg提取組織蛋白使用10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白,將分離的蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。轉印好的PVDF膜放置在TBST溶液配制好的脫脂牛奶中封閉1 h。所有的PVDF膜置入含有山羊抗c-Kit(1∶1 000;R&D Systems,Minneapolis,USA)、山羊抗mSCF(1∶1 000;R&D Systems,Minneapolis,USA)和兔抗小鼠GAPDH(1∶2 000;GeneTex,San Antonio,TX,USA)孵育過夜。TBST液中漂洗3次,PVDF膜轉至1∶2 000的抗兔二抗或抗山羊二抗中室溫孵育1 h。TBST溶液洗滌3次后,采用電化學發光(ECL)顯色試劑盒進行曝光。Alphaview軟件對曝光圖像進行分析定量。

1.5逆轉錄(RT)-聚合酶鏈反應(PCR)檢測 胃組織mRNA表達檢測采用RT-PCR法。胃組織RNA使用Trizol試劑提取,使用PrimeScript RT Master Mix(Takara,Otsu,Japan)將提取的RNA轉化為cDNA。mSCF和c-Kit特異性引物序列為：c-Kit mRNA正義鏈：5′-GACCCGACGCAACTTCCTTA-3′,反義鏈：5′-GAGCATCTTCACGGCAACTGT-3′;mSCF mRNA正義鏈：5′-GGAAAATAGTGGATGACCTCG TG-3′,反義鏈：5′-TGGAATCTTTCTCGGGACCTAA-3′。數據分析公式為：△Ct= CT,Target -CT,GAPDH,然后代入公式=2-ΔΔCt計算出各組中c-Kit、mSCF基因的相對RNA表達水平。

2 結 果

2.1電針刺激對體質量和血糖的影響 造模成功后2、4、6、8 w,Control組體質量均明顯高于其余3組(均P<0.05),造模成功后8 w,DM+EA組體質量明顯高于DM組(P<0.05);造模成功及造模成功后2、4、6、8 w,Control組血糖水平均明顯低于其余3組(均P<0.05),DM組和DM+EA組同一時間點血糖水平差異無統計學意義(均P>0.05)。見表1、表2。

表1 各組體質量監測變化

表2 各組血糖水平變化

2.2電針刺激對胃排空的作用 與Control組胃排空率〔(0.61±0.014)%〕相比,DM組〔(0.40±0.013)%〕和DM+SEA組〔(0.41±0.024)%〕均明顯降低(均P<0.05),DM+EA組〔(0.56±0.012)%〕胃排空率明顯高于DM組(P<0.05)。

2.3電針刺激對mSCF-Kit信號的影響 與Control組比較,DM組和DM+SEA組c-Kit、mSCF蛋白和mRNA水平均明顯降低(均P<0.05);與DM組比較,DM+EA組c-Kit、mSCF蛋白和mRNA水平明顯升高(均P<0.05)。見圖1、表3、表4。

表3 各組c-Kit和SCF蛋白相對表達水平

表4 各組c-Kit和SCF mRNA相對表達水平

2.4電針刺激對ICC 網絡的影響 Control組肌間可見濃密、明亮而完整的Ano1陽性和c-Kit陽性ICC網絡;而DM組和DM+SEA組Ano1陽性和c-Kit陽性ICC細胞網絡可見亮度明顯減弱,數目顯著減少,甚至消失,網絡出現破壞中斷。與DM組比較,DE+EA組肌間Ano1陽性和c-Kit陽性ICC細胞網絡亮度明顯增加,細胞間銜接完整,未見明顯網絡中斷、破壞表現。見圖2。

圖2 各組Ano1和c-Kit陽性ICC網絡(免疫熒光染色,×200)

3 討 論

DM胃輕癱是DM主要并發癥之一,臨床上主要表現為腹脹、惡心、嘔吐等不適,胃鏡檢查可見明顯胃潴留,研究發現DM胃輕癱的發生可能與肌間ICC的損傷和缺失明顯相關〔7〕。電針刺激作為祖國傳統醫學針刺與電流刺激的結合,研究發現其在臨床治療胃腸動力障礙性疾病具有一定的療效〔8〕。胃排空延遲是導致DM胃輕癱患者腹脹、惡心等腹部不適癥狀的主要原因,臨床上促胃動力藥物在一定程度上可以改善患者的臨床癥狀。有研究發現,電針刺激可以改善手術患者的胃排空功能〔10〕,本研究也發現,電針刺激同樣可以促進DM小鼠胃排空率。同時,本研究發現電針刺激并不能改善DM小鼠血糖水平,但可以改善DM小鼠體質量減輕的狀態,推測可能與電針刺激促進胃排空后在一定程度上改善DM小鼠營養狀態相關。

ICC細胞是胃腸道蠕動波電活動起搏細胞,可以觸發電活動形成胃腸道蠕動波,促進攝入食物在消化道的傳輸〔11,12〕。C-Kit是酪氨酸蛋白激酶受體,在胃腸道組織中表達在ICC和極少量肥大細胞表面,是ICC細胞經典的標記物〔13〕。而Ano1是鈣離子激活的氯離子通道蛋白,在胃腸道組織中表達在c-kit陰性在內的所有ICC表面,但不表達在肥大細胞表面〔14〕。因此,Ano1作為胃腸道組織內ICC標記物具有更好的特異性和靈敏性。研究已證實DM狀態下胃組織內Ano1和c-kit陽性ICC均明顯減少〔7〕。本研究也提示,DM小鼠在8 w時胃組織內Ano1和c-Kit陽性ICC明顯減少,但電針刺激可以改善這種情況,維持Ano1陽性ICC和c-Kit陽性細胞表達。M-SCF是c-kit配體,研究發現兩者在促進和維持ICC增殖、分化和生存方面具有重要的作用〔9〕。本研究也發現,電針刺激可以促進mSCF和c-kit蛋白和mRNA水平的表達,進一步推測電針刺激可能通過促進和維持mSCF/c-Kit信號表達,維持ICC的完整性和功能。