干擾hsa_circ_0023404通過miR-153對肝癌細(xì)胞HCC9204增殖、侵襲、遷移、凋亡的影響

羅成 蘇斌 高燕妮

(聯(lián)勤保障部隊第九二○醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,云南 昆明 650032)

肝癌是常見的惡性腫瘤之一〔1〕,主要治療方法包括根治性切除和化學(xué)療法。由于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的頻率很高,肝癌患者的預(yù)后仍然很差,其5年生存率低于25%〔2〕。因此,進一步了解肝癌進展的分子機制,尋找用于肝癌診斷的新型生物標(biāo)志物和確定有效的治療靶標(biāo)十分迫切。環(huán)狀RNA(circRNA)普遍存在于哺乳動物細(xì)胞中,是單鏈RNA的共價閉合連續(xù)環(huán)型,并調(diào)節(jié)基因表達(dá)〔3〕。CircRNA可以充當(dāng)競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA),通過直接與微小RNA(miRNA)結(jié)合來海綿化其靶標(biāo)miRNA,調(diào)節(jié)其活性〔4〕。circRNA在幾種癌癥組織中異常表達(dá),其在腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用已得到證明〔5〕。Hsa_circ_0023404,一種新型鑒定的circRNA,據(jù)報道在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)均上調(diào),通過調(diào)節(jié)miR-217/鋅指E盒結(jié)合同源盒蛋白(ZEB)1軸促進非小細(xì)胞肺癌的增殖、遷移和侵襲〔6〕。hsa_circ_0023404通過調(diào)節(jié)miR-136/轉(zhuǎn)錄因子(TF)CP2/Hippo/Yes相關(guān)蛋白(YAP)途徑在宮頸癌中發(fā)揮致癌作用〔7〕。長度約為22 nt的miRNA是生物過程中的重要介體,它們通過抑制翻譯或直接降解目標(biāo)mRNA來負(fù)調(diào)控基因表達(dá)〔8〕。miR-153在肝癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào),對肝癌細(xì)胞具有抗遷移和抗侵襲的能力〔9〕。miR-153通過靶向Snail抑制肝癌細(xì)胞的上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化〔10〕。然而,hsa_circ_0023404的分子功能及其潛在的下游miRNA靶基因在肝癌發(fā)病機制中的作用尚未得到探索?；诖?本研究考察hsa_circ_0023404在肝癌組織中的表達(dá)及對肝癌細(xì)胞HCC9204增殖、侵襲、遷移、凋亡的影響,通過探討hsa_circ_0023404與miR-153之間靶向關(guān)系,旨在闡明其潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 收集2016年3月至2017年6月于聯(lián)勤保障部隊第九二○醫(yī)院的39例手術(shù)切除的肝癌及鄰近的非腫瘤標(biāo)本(癌旁組織)。排除收集前接受化學(xué)療法或放射療法的患者。樣本均在患者同意下收集并簽名知情同意,經(jīng)病理學(xué)確診為肝癌。實驗方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

肝癌細(xì)胞HCC9204(上海晶抗生物工程有限公司),Trizol試劑、Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司),TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Applied Biosystems),One Step PrimeScript cDNA試劑盒(德國Qiagen),Roswell Park Memorial Institute RPMI1640培養(yǎng)基、結(jié)晶紫(北京Solarbio),si-NC、si-hsa_circ_0023404、miR-NC、miR-153模擬物、anti-miR-NC、miR-153抑制劑(上海GenePharma),細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8(上海Beyotime),膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國BioVision),pGL3 Basic報告載體、雙螢光素酶測定系統(tǒng)(美國Promega),Quick Change Lightning試劑盒(美國Stratagene)。

1.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 應(yīng)用Trizol試劑從肝癌組織和癌旁組織中分離總RNA。cDNA的合成使用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(miR-153)及One Step PrimeScript cDNA試劑盒(hsa_circ_0023404)進行。使用Applied Biosystems GeneAmp 7500系統(tǒng)一式3份進行qRT-PCR確定hsa_circ_0023404表達(dá)。同時,進行TaqMan MicroRNA分析評估m(xù)iR-153 表達(dá)。GAPDH被用作hsa_circ_0023404的內(nèi)源參考基因,而U6被用作miR-153的加載對照。使用2-ΔΔCt方法計算hsa_circ_0023404、miR-153 mRNA相對表達(dá)。引物如下：has-circ_0023404正向：5′-CTGGTGCAGTGGAAGCAGAG-3′,反向：5′-CGACCCTCCATTGCTCTTCT-3′;miR-153正向：5′-TTGCATAGTCACAAA AGTGAT-3′,反向：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;GAPDH正向：5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′,反向：5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′;U6正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′,反向：5′-ACGC TTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將肝癌細(xì)胞HCC9204在RPMI1640培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清(FBS),在37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。肝癌細(xì)胞HCC9204分為si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC),si-hsa_circ_0023404組(轉(zhuǎn)染si-hsa_circ_0023404),miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC),miR-153組(轉(zhuǎn)染miR-153模擬物),si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組(共轉(zhuǎn)染si-hsa_circ_0023404和anti-miR-NC),si-hsa_circ_0023404+anti-miR-153組(共轉(zhuǎn)染si-hsa_circ_0023404+miR-153抑制劑)。使用Lipofectamine 2000將這些質(zhì)粒按照分組轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞HCC9204中。轉(zhuǎn)染后48 h,收獲細(xì)胞,根據(jù)1.2中qRT-PCR測定hsa_circ_0023404和miR-153表達(dá),并用于以下研究。

1.4CCK-8測定 將肝癌細(xì)胞HCC9204以2×103個細(xì)胞/孔接種在96孔板中,并在含有10% FBS的培養(yǎng)基中生長24 h。細(xì)胞HCC9204以1.3中不同分組轉(zhuǎn)染后,將10 μl CCK-8溶液添加到每個孔中,并將細(xì)胞在5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育2 h。使用Bio-Rad分光光度計讀取每個孔在450 nm處的吸光度(OD)值,以(1-OD實驗組/OD對照組)×100%計算抑制率(%)。

1.5平板克隆實驗 將肝癌細(xì)胞HCC9204以2×103個細(xì)胞/孔接種在6孔板中,并在含有10% FBS的培養(yǎng)基中生長。14 d后,將細(xì)胞HCC9204用甲醇固定,結(jié)晶紫染色,統(tǒng)計集落(>50個細(xì)胞)的形成數(shù)。

1.6流式細(xì)胞術(shù) 肝癌細(xì)胞HCC9204(5×105個細(xì)胞)根據(jù)制造商的說明步驟,用Annexin V-FITC和PI進行染色,并于流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.7Western印跡 收獲肝癌細(xì)胞HCC9204并在RIPA緩沖液中裂解提取總蛋白。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離50 μg的蛋白,并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后,將膜與抗B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、抗E-鈣黏蛋白(cadherin)、抗N-cadherin和抗GAPDH(對照)一抗在4 ℃孵育12 h。之后,將二抗與膜一起孵育。電化學(xué)發(fā)光(ECL)底物用于可視化蛋白條帶,在成像系統(tǒng)和Image LabTM軟件v5.2.1通過光密度分析法對蛋白條帶進行定量。

1.8Transwell測定 在8.0 μmol/L孔膜的Transwell小室進行測定。侵襲實驗：將肝癌細(xì)胞HCC9204(1×105個細(xì)胞)重懸于200 μl不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中,然后用基質(zhì)膠包被頂室中。將500 μl含10% FBS的培養(yǎng)基作為化學(xué)吸引劑添加到底部腔室中。溫育后24 h后,用棉簽輕輕移出Transwell膜上表面的細(xì)胞,并用甲醇固定Transwell膜下表面的細(xì)胞,用0.5%結(jié)晶紫染色,并在倒置顯微鏡下計數(shù)侵襲的細(xì)胞。遷移實驗：Transwell頂室未用基質(zhì)膠包被,其余步驟相同。

1.9雙熒光素酶報告實驗 在生物信息學(xué)預(yù)測軟件Circular RNA Interactome中預(yù)測hsa_circ_0023404與miR-153的靶向結(jié)合。擴增含有miR-153預(yù)測結(jié)合位點的野生型(wt)has-circ_0023404序列,并亞克隆到pGL3 Basic報告載體中,生成wt-circ_0023404。使用Quick Change Lightning試劑盒進行定點誘變,以構(gòu)建has-circ_0023404的突變型(mut)序列,并生成mut-circ_0023404。用wt-circ_0023404,mut-circ_0023404與miR-153模擬物、陰性對照miR-NC轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HCC9204。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞,并按照制造商的說明使用雙螢光素酶測定系統(tǒng)進行分析。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1hsa_circ_0023404和miR-153在肝癌中的表達(dá) 39例肝癌組織中hsa_circ_0023404表達(dá)量(5.40±0.37)明顯高于癌旁組織(1.00±0.11),miR-153表達(dá)量(0.26±0.05)明顯低于癌旁組織(1.00±0.10;t=71.86、12.057,均P=0.000)。

2.2干擾hsa_circ_0023404對細(xì)胞HCC9204增殖凋亡的影響 如圖1、表1所示,在肝癌細(xì)胞HCC9204中轉(zhuǎn)染si-hsa_circ_0023404以干擾hsa_circ_0023404表達(dá),發(fā)現(xiàn)si-hsa_circ_0023404組hsa_circ_0023404表達(dá)量明顯低于si-NC組(P<0.05),提示成功干擾hsa_circ_0023404。與si-NC組相比,si-hsa_circ_0023404組細(xì)胞HCC9204的miR-153表達(dá)量、抑制率明顯增加,集落形成數(shù)明顯減少,凋亡率和Bax蛋白表達(dá)明顯升高,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

表1 干擾hsa_circ_0023404對細(xì)胞HCC9204增殖凋亡的影響

1～2：si-NC組,si-hsa-circ_0023404組

2.3干擾hsa_circ_0023404對細(xì)胞HCC9204遷移、侵襲的影響 如表2、圖2、圖3所示,細(xì)胞HCC9204中干擾hsa_circ_0023404后,si-hsa_circ_0023404組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)低于si-NC組,而E-cadherin蛋白表達(dá)量高于si-NC組,N-cadherin蛋白表達(dá)量低于si-NC組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 干擾hsa_circ_0023404對細(xì)胞HCC9204遷移侵襲的影響

圖2 干擾hsa_circ_0023404對細(xì)胞HCC9204遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

1～6：si-NC組、si-hsa-circ_0023404組、miR-NC組、miR-153組、si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組、si-hsa_circ_0023404+anti-miR-153組圖3 兩組E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)

2.4hsa_circ_0023404和miR-153靶向關(guān)系的驗證 如圖4、表3所示,Circular RNA Interactome(生物信息學(xué)預(yù)測軟件)中預(yù)測到hsa_circ_0023404和miR-153的靶向結(jié)合位點。miR-153模擬物與wt-hsa_circ_0023404共轉(zhuǎn)染時細(xì)胞HCC9204的熒光活性明顯低于miR-NC與wt-hsa_circ_0023404共轉(zhuǎn)染時(P<0.05),miR-153模擬物或miR-NC與mut-hsa_circ_0023404共轉(zhuǎn)染時,細(xì)胞HCC9204的熒光活性不存在統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表3 雙熒光素酶報告實驗

圖4 hsa_circ_0023404和miR-153的互補序列

2.5miR-153對細(xì)胞HCC9204增殖凋亡的影響 如圖5、表4所示,在肝癌細(xì)胞HCC9204中轉(zhuǎn)染miR-153模擬物,結(jié)果顯示,miR-153組miR-153表達(dá)量和抑制率較miR-NC組高,集落形成數(shù)較miR-NC組低,凋亡率和Bax蛋白表達(dá)較miR-NC組高,Bcl-2蛋白表達(dá)量較miR-NC組低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表4 miR-153對細(xì)胞HCC9204增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

1～2：miR-NC組,miR-153組

2.6miR-153對細(xì)胞HCC9204遷移侵襲的影響 如圖3、表4、圖6所示,miR-153組較miR-NC組減少細(xì)胞HCC9204的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù),增加E-cadherin蛋白表達(dá),降低N-cadherin蛋白表達(dá),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

圖6 miR-153對細(xì)胞HCC9204遷移侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)的影響

2.7抑制miR-153可逆轉(zhuǎn)干擾hsa_circ_0023404對細(xì)胞HCC9204增殖凋亡的影響 如圖7、表5所示,si-hsa_circ_0023404+anti-miR-153組細(xì)胞HCC9204的miR-153表達(dá)量和抑制率較si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組低,集落形成數(shù)較si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組高,凋亡率和Bax蛋白表達(dá)較si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組低,Bcl-2蛋白表達(dá)量較si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表5 抑制miR-153可逆轉(zhuǎn)干擾hsa_circ_0023404對細(xì)胞HCC9204增殖凋亡的影響

1～2：si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組,si-hsa_circ_0023404+anti-miR-153組

2.8抑制miR-153可逆轉(zhuǎn)干擾hsa_circ_0023404對細(xì)胞HCC9204遷移侵襲的影響 如圖3、表6、圖8所示,si-hsa_circ_0023404+anti-miR-153組細(xì)胞HCC9204的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)高于si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組,E-cadherin蛋白表達(dá)量低于si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組,N-cad-herin蛋白表達(dá)量高于si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表6 抑制miR-153可逆轉(zhuǎn)干擾hsa_circ_0023404對細(xì)胞HCC9204遷移侵襲的影響

圖8 抑制miR-153可逆轉(zhuǎn)干擾hsa_circ_0023404對細(xì)胞HCC9204遷移侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)的影響

3 討 論

肝癌的臨床特征是侵襲性,預(yù)后差和治療機會有限,發(fā)病率和死亡率仍然很高〔11〕。更重要的是對肝癌的分子發(fā)病機制和治療靶標(biāo)知之甚少。因此,了解肝癌的致病過程及其調(diào)控機制對肝癌的管理具有重要意義。

異常表達(dá)circRNA在肝癌發(fā)生和進展起著至關(guān)重要作用,可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞惡性行為,包括癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡〔12〕。有研究已經(jīng)確定hsa_circ_0023404是腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子〔6〕。與相鄰的正常組織相比,宮頸癌組織中circRNA hsa_circ_0023404顯著上調(diào),與患者的預(yù)后不良有關(guān)。在功能上,敲低hsa_circ_0023404可以顯著抑制增殖,阻滯細(xì)胞周期進程并抑制宮頸癌中的細(xì)胞遷移和侵襲〔7〕。hsa_circ_0023404通過海綿miR-5047,進而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)A基因的表達(dá)和自噬信號傳導(dǎo)途徑,促進宮頸癌轉(zhuǎn)移和對順鉑的化學(xué)耐藥性〔13〕。hsa_circ_0023404高表達(dá)預(yù)示著非小細(xì)胞肺癌總體生存期短,敲低hsa_circ_0023404可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。盡管已經(jīng)開始闡明hsa_circ_0023404在腫瘤發(fā)生中的作用,但目前尚不了解hsa_circ_0023404在肝癌病理進展中的表達(dá)及其調(diào)控機制。研究結(jié)果表明,hsa_circ_0023404在肝癌進程中起致癌作用,并可能成為肝癌的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物和有希望的治療靶標(biāo)。

miR-153在各種癌癥中異常表達(dá),并在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用〔14,15〕。在人膀胱移行細(xì)胞乳頭瘤細(xì)胞(RT4)進行的功能獲得研究表明,miR-153在膀胱癌中具有抗侵襲、抗遷移作用〔16〕。在宮頸癌細(xì)胞系中的功能研究表明,Hela、C-33A細(xì)胞中miR-153過表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)人多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(GALNT)7表達(dá),從而減弱細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,表明miR-153具有抑癌活性〔17〕。在人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中,miR-153敲低通過靶向人蝸牛同源物1(果蠅)樣1蛋白(SNAI1)抑制PCI-13細(xì)胞的遷移和侵襲〔18〕。miR-153在非小細(xì)胞肺癌中通過靶向SRC促癌基因抑制細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移,并促進細(xì)胞凋亡〔19〕。此外,與正常肝上皮細(xì)胞和相匹配的正常肝組織相比,miR-153在肝癌細(xì)胞系和組織表達(dá)明顯下調(diào)。miR-153異位表達(dá)抑制了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,而抑制miR-153可以挽救這種抑制作用〔20〕。本研究數(shù)據(jù)再次支持了上述觀點,即miR-153在肝癌組織中低表達(dá),且充當(dāng)抑癌因子,抑制肝癌細(xì)胞HCC9204的增殖、侵襲和侵襲及誘導(dǎo)凋亡。

眾所周知,circRNA可以結(jié)合其靶向的miRNA,并作為ceRNA發(fā)揮作用,從而抑制這些miRNA并抑制其活性〔21〕。Hsa_circ_0023404充當(dāng)miR-136海綿,以增加基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達(dá)并抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的形成〔22〕。但是,尚未探討miR-153在hsa_circ_0023404介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的潛在作用。本研究發(fā)現(xiàn),hsa_circ_0023404靶向肝癌細(xì)胞中的miR-153,因為miR-153過表達(dá)減輕了wt-hsa_circ_0023404調(diào)節(jié)的熒光素酶活性,而干擾hsa_circ_0023404提高了肝癌細(xì)胞HCC9204中miR-153的表達(dá)。更重要的是,抑制miR-153后,逆轉(zhuǎn)了干擾hsa_circ_0023404對肝癌細(xì)胞HCC9204惡性行為的影響。這些發(fā)現(xiàn)可能為circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)上,hsa_circ_0023404靶向miR-153以調(diào)控肝癌進程的分子調(diào)控途徑提供新的見解。

綜上,hsa_circ_0023404在肝癌組中被上調(diào),干擾其表達(dá)可以減弱肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,同時促進凋亡。此外,hsa_circ_0023404通過靶向miR-153來增強肝癌細(xì)胞的惡性行為。