半夏組織培養(yǎng)中光照條件對(duì)生長(zhǎng)和有效成分積累的影響

李冠男，黃惠英，王寶春，張慶霞，高 峰，安 賢

（1.甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.西河縣天正農(nóng)牧業(yè)發(fā)展有限公司，甘肅 西河 730020）

半夏（Pinellia ternata）是一種具有重要藥用價(jià)值的植物，廣泛應(yīng)用于中藥領(lǐng)域。它含有多種生物活性成分，如生物堿、揮發(fā)油、多糖等，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、消腫、止吐等藥理作用。研究光照條件對(duì)半夏組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)和有效成分積累的影響具有重要的背景和意義。傳統(tǒng)的半夏采集方式依賴于天然資源，存在著數(shù)量有限、生長(zhǎng)環(huán)境受限、地域分布不均等問(wèn)題，導(dǎo)致半夏的種植和供應(yīng)受到限制，難以滿足藥用需求。而利用組織培養(yǎng)技術(shù)，可以通過(guò)無(wú)菌條件下培養(yǎng)植物組織，實(shí)現(xiàn)對(duì)半夏生長(zhǎng)和有效成分積累的控制，從而提高半夏的產(chǎn)量和質(zhì)量。光照是植物生長(zhǎng)和代謝的重要環(huán)境因素之一。適宜的光照條件對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、光合作用和次生代謝產(chǎn)物的合成都有著顯著的影響。對(duì)于半夏組織培養(yǎng)而言，通過(guò)調(diào)控光照條件可以控制植物的生長(zhǎng)速度、生物量積累以及有效成分的合成和積累。研究光照條件對(duì)半夏組織培養(yǎng)的影響，可以為優(yōu)化半夏的生長(zhǎng)條件、提高其產(chǎn)量和質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇甘肅省農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院組培中心半夏的組培苗為材料，隨機(jī)選取直徑為1.5～2 cm、質(zhì)量2 g 左右完整無(wú)病的半夏塊莖，消毒后，栽種于塑料盆（上口直徑22 mm，高16 mm，下口直徑14 mm）內(nèi)，播種深度5 cm。每盆種植5 顆半夏塊莖，共設(shè)9個(gè)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)土壤

供試土壤為西河縣天正農(nóng)牧業(yè)發(fā)展有限公司中藥材資源圃內(nèi)耕作層土壤，砂壤土，含水量25.31%。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

不同光照條件對(duì)半夏生長(zhǎng)和有效成分積累設(shè)計(jì)：使用不同顏色的濾光膜獲得不同光質(zhì)，共設(shè)置，設(shè)白膜、黃色膜、藍(lán)色膜、紅色、綠色膜5 個(gè)處理。當(dāng)每盆半夏出苗過(guò)半時(shí)，移至西河縣天正農(nóng)牧業(yè)發(fā)展有限公司中藥材資源圃濾光膜內(nèi)，待倒苗后，收集塊蓮、珠芽、種子。

1.4 觀察指標(biāo)

待半夏出苗后每5 d 對(duì)葉長(zhǎng)、葉寬、株高進(jìn)行一次測(cè)量。待倒苗后收取半夏塊莖計(jì)算有效成分積累量。

還原糖含量測(cè)定：將2 g菲林和0.5 g蘇丹藍(lán)溶解在1 L水中，并加熱攪拌至完全溶解。然后冷卻并過(guò)濾，得到菲林-蘇丹藍(lán)試劑。將半夏樣品研磨成細(xì)粉。取一定量的1 g 半夏粉末放入錐形瓶中。向錐形瓶中加入足夠的菲林-蘇丹藍(lán)試劑，使半夏粉末完全浸沒(méi)在溶液中。將錐形瓶放入沸水中加熱5 min。將錐形瓶冷卻至室溫。使用紫外可見光分光光度計(jì)將溶液的吸光度測(cè)定在515 nm 處。準(zhǔn)備一系列含量已知的還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按照相同的步驟測(cè)定吸光度。將吸光度與還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定還原糖的含量。

可溶性糖含量測(cè)定：將半夏研磨成細(xì)粉。取1 g 半夏粉末放入離心管中。向離心管中加入足夠的酚硫酸試劑（5 g酚和50 mL濃硫酸混合），使樣品完全浸沒(méi)在試劑中。用離心管蓋蓋好，輕輕震蕩混合，使樣品均勻接觸試劑。將離心管放入水浴中，加熱10 min。將離心管冷卻至室溫。使用離心機(jī)將離心管離心10 min，以分離固體殘?jiān)鸵合唷⑸锨逡海ㄒ合啵┺D(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中。根據(jù)樣品的濃度，適當(dāng)稀釋液相，以確保在光度計(jì)范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)量。使用紫外可見光分光光度計(jì)，在特定波長(zhǎng)下（通常為485 nm），測(cè)定溶液的吸光度。準(zhǔn)備一系列含量已知的可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按照相同的步驟測(cè)定吸光度。將吸光度與可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定可溶性糖的含量。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：取一定量的半夏粉末（例如1 g）放入離心管中。向離心管中加入足夠的Bradford 試劑，使樣品完全浸沒(méi)在試劑中。用離心管蓋蓋好，輕輕震蕩混合，使樣品均勻接觸試劑。將離心管孵育在室溫下15 min，使蛋白質(zhì)與Bradford 染色劑發(fā)生反應(yīng)。使用離心機(jī)將離心管離心5 min，以分離固體殘?jiān)鸵合唷⑸锨逡海ㄒ合啵┺D(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中。使用分光光度計(jì)，在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光度。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)Bradford 試劑盒中提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的濃度，制備一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按照相同的步驟測(cè)定吸光度。將吸光度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定蛋白質(zhì)的含量。

生物堿含量測(cè)定：將一定量的半夏粉末稱取入離心管中，并加入適量的乙腈和磷酸鹽緩沖液，充分混合，并用超聲波提取儀進(jìn)行提取。將提取后的樣品離心，以去除固體殘?jiān)玫酱治龅奶崛∫骸８鶕?jù)需要測(cè)定的目標(biāo)生物堿，準(zhǔn)備一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入HPLC系統(tǒng)，按照分析方法進(jìn)行分析，記錄各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積和濃度的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將提取液中的樣品注入HPLC 系統(tǒng)的進(jìn)樣器中，按照分析方法進(jìn)行分析。設(shè)置HPLC 系統(tǒng)的分析條件，包括色譜柱類型、流動(dòng)相組成、流速、檢測(cè)器波長(zhǎng)等參數(shù)，以確保目標(biāo)生物堿在色譜柱上得到良好的分離和檢測(cè)。使用HPLC系統(tǒng)的數(shù)據(jù)采集軟件，記錄樣品峰面積，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量計(jì)算生物堿的含量。

鳥苷、鳥苷含量測(cè)定方法與生物堿含量測(cè)定類似。

2 結(jié)果

2.1 半夏生產(chǎn)情況

3 種處理期間，黃色膜、藍(lán)色膜、紅色膜下的半夏葉面積都在增長(zhǎng)中，白色膜和綠色膜下則不明顯。在黃色膜、藍(lán)色膜下的半夏葉片葉面積最大，紅色、白色膜次之，綠色膜下的半夏葉片葉面積最小，詳見表1。

表1 不同光照對(duì)半夏葉面積的影響（±s，n=3）Tab.1 Effect of different illumination on leaf area of Pinellia ternata

表1 不同光照對(duì)半夏葉面積的影響（±s，n=3）Tab.1 Effect of different illumination on leaf area of Pinellia ternata

15 d 處理5 d 10 d 21.45±1.321 4 14.26±1.124 5 21.25±1.231 5 23.75±1.482 1 27.34±4.458 4白色膜綠色膜紅色膜藍(lán)色膜黃色膜20.42±2.012 3 14.96±1.469 5 17.25±1.896 1 18.27±2.215 4 20.21±0.862 1 16.54±1.712 5 16.39±1.125 4 22.01±2.615 4 24.03±2.154 1 28.54±1.215 4

半夏的株高在處理期間都處于增長(zhǎng)中，在處理后，白色膜和黃色膜下的半夏株高最大，紅色膜、綠色膜次之，藍(lán)色膜下的最小，詳見表2。

表2 不同光照對(duì)半夏株高的影響（±s，n=3）Tab.2 Effect of different illumination on plant height of Pinellia ternata

表2 不同光照對(duì)半夏株高的影響（±s，n=3）Tab.2 Effect of different illumination on plant height of Pinellia ternata

15 d 20.48±0.5954 18.02±0.8124 18.42±0.8154 16.11±0.6941 18.33±0.8412處理白色膜綠色膜紅色膜藍(lán)色膜黃色膜5 d 6.15±0.2621 5.19±0.2415 5.27±0.2145 5.02±0.2457 5.71±0.8512 10 d 16.11±1.0201 15.91±1.0454 13.61±1.0354 15.34±1.0324 15.03±1.0321

2.2 不同光強(qiáng)對(duì)半夏塊室鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、繁殖系數(shù)的影響

黃色膜、白色膜下半夏塊蓮的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量最大，紅色膜、黃色膜、綠色膜最小；紅色膜、白色膜下的半夏珠芽數(shù)最多，繁殖系數(shù)最大，藍(lán)色膜、綠色膜次之，黃色膜下最小。說(shuō)明黃色膜可以促進(jìn)半夏塊基質(zhì)量的增長(zhǎng)，而紅色膜促進(jìn)半夏珠芽的形成，促進(jìn)半夏的繁殖，詳見表3。

表3 不同光強(qiáng)對(duì)半夏塊室鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、繁殖系數(shù)的影響（±s，n=3）Tab.3 Effects of different light intensity on fresh weight,dry weight and reproduction coefficient of Pinellia ternata

表3 不同光強(qiáng)對(duì)半夏塊室鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、繁殖系數(shù)的影響（±s，n=3）Tab.3 Effects of different light intensity on fresh weight,dry weight and reproduction coefficient of Pinellia ternata

處理鮮質(zhì)量/g干質(zhì)量/g珠芽數(shù)/個(gè)繁殖系/數(shù)白色膜綠色膜紅色膜藍(lán)色膜黃色膜3.132 4±0.102 1 2.661 2±0.081 2 2.516 5±0.098 1 2.596 1±0.109 2 3.042 5±0.130 1 0.841 2 0.712 5 0.541 5 0.631 5 0.853 5 9.651±0.691 2 7.1025±0.712 5 10.152±0.614 5 8.921±0.612 4 6.569±0.779 5 16.77±0.564 1 14.09±0.712 5 17.91±0.451 2 16.09±0.471 5 14.02±0.771 5

2.3 不同光強(qiáng)對(duì)半夏有效成分積累的影響

黃色膜下的半夏塊墓可溶性還原糖、總糖、生物堿及琥泊酸含量最高，可溶性蛋白和鳥苦含量最低。藍(lán)色膜下，半夏塊蓮總糖最低，可溶性還原糖、生物堿及琥拍酸含量較低，可溶性蛋白和鳥苷含量最高。紅色膜下的半夏塊蓮生物堿、鳥苦含量最低，總糖含量較高，其他成分含量較低。綠色膜下半夏塊蓮除琥拍酸含量較高外，其他各化學(xué)成分都較低。白色膜下，有效成分積累含量都較高，詳見表4。

表4 不同光強(qiáng)對(duì)半夏有效成分積累的影響對(duì)比（-x±s，n=3）Tab.4 Comparison of effect of different light intensity on accumulation of effective components in Pinellia ternata

3 討論

光對(duì)植物的形態(tài)發(fā)育具有重要影響。植物對(duì)光的方向、強(qiáng)度和光周期的感知能力決定其的生長(zhǎng)方向、葉片展開和莖伸長(zhǎng)等。植物對(duì)不同光質(zhì)的光具有感知和響應(yīng)能力，并通過(guò)不同的光形態(tài)建成反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程。第一類光形態(tài)建成反應(yīng)主要受紅光和遠(yuǎn)紅光的調(diào)節(jié)。在植物生長(zhǎng)環(huán)境中，紅光主要來(lái)自于陽(yáng)光和白熾燈等光源，而遠(yuǎn)紅光主要來(lái)自于遠(yuǎn)紅外線輻射。植物對(duì)紅光和遠(yuǎn)紅光的比例變化非常敏感，并根據(jù)其接收到的光質(zhì)信息來(lái)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和發(fā)育。紅光主要促進(jìn)植物的光合作用和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。當(dāng)植物接收到較高比例的紅光時(shí)，可以促進(jìn)葉綠素的合成和光合作用的進(jìn)行，從而增加光合產(chǎn)物（如碳水化合物）的積累。此外，紅光還可以促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)和細(xì)胞分裂，影響植物的形態(tài)和構(gòu)型。遠(yuǎn)紅光主要參與植物的光形態(tài)建成反應(yīng)。當(dāng)植物接收到較高比例的遠(yuǎn)紅光時(shí)，會(huì)抑制莖的伸長(zhǎng)、促進(jìn)側(cè)芽的分化和開花的誘導(dǎo)。遠(yuǎn)紅光可以影響植物的形態(tài)建成，如控制植物的高度和側(cè)枝的分布。第二類光形態(tài)建成反應(yīng)主要受藍(lán)光和近紫外光的調(diào)節(jié)。藍(lán)光和近紫外光主要來(lái)自于天空的光線。植物對(duì)藍(lán)光和近紫外光的比例變化也會(huì)引發(fā)一系列生理反應(yīng)。藍(lán)光對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育具有多種影響，可以促進(jìn)植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成和積累，對(duì)葉片的展開和莖的伸長(zhǎng)有促進(jìn)作用。此外，藍(lán)光還參與光敏感色素的合成、調(diào)控植物的開花時(shí)間和根的形成等過(guò)程。近紫外光對(duì)植物的影響較少研究，但已知它可以參與植物的光形態(tài)建成反應(yīng)，調(diào)控植物的開花、莖伸長(zhǎng)和根的形成。不同光質(zhì)對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育具有不同的調(diào)節(jié)作用。紅光和遠(yuǎn)紅光主要調(diào)節(jié)植物的光合作用、伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和形態(tài)建成；藍(lán)光和近紫外光主要調(diào)節(jié)植物的蛋白質(zhì)合成、開花時(shí)間和根的形成。深入了解光質(zhì)的作用機(jī)制有助于優(yōu)化植物的生長(zhǎng)環(huán)境和提高農(nóng)作物產(chǎn)量。

本次研究通過(guò)使用不同光照條件對(duì)半夏生產(chǎn)進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)黃色膜下的半夏植物表現(xiàn)出葉面積增長(zhǎng)、株高增加、塊蓮質(zhì)量增加以及較高的可溶性還原糖、總糖、生物堿和琥拍酸含量。紅色膜下的半夏植物則促進(jìn)了珠芽的形成和繁殖，且總糖含量較高。藍(lán)色膜下的半夏植物總糖含量較低，可溶性還原糖、生物堿和琥拍酸含量較低，但可溶性蛋白和鳥苷含量較高。綠色膜下的半夏植物除了琥拍酸含量較高外，其他化學(xué)成分含量較低。白色膜下各化學(xué)成分的積累含量較高。說(shuō)明黃色膜能夠促進(jìn)半夏的生長(zhǎng)發(fā)育和塊蓮質(zhì)量的增加，且增加了可溶性還原糖、總糖、生物堿和琥拍酸的含量；紅色膜促進(jìn)了半夏的繁殖，特別是珠芽的形成，同時(shí)增加了總糖的含量；藍(lán)色膜下的半夏植物在化學(xué)成分上表現(xiàn)出與其他膜下不同的特點(diǎn)，可溶性蛋白和鳥苷含量較高，但總糖含量較低；綠色膜下的半夏植物除了琥拍酸含量較高外，其他化學(xué)成分的含量相對(duì)較低；白色膜下半夏植物各化學(xué)成分的積累較高。

綜上，黃色膜可促進(jìn)半夏生長(zhǎng)發(fā)育，紅色膜可促進(jìn)半夏株芽形成，且紅色膜下繁殖系數(shù)最大，可使用紅光提高半夏產(chǎn)量。