固氮功能性菌肥的研制及其對鹽堿土壤性質的影響

馬立強，王小丹，張 晨，，張海潮，郭愛紅

（1.華北理工大學，河北 唐山 063210；2.唐山天予環境檢測有限公司，河北 唐山 063210）

氮素是植物生長過程中所必需的三大營養元素之一[1]。雖然土壤中全氮含量很多，但可直接利用的速效氮含量較少。因此，施用氮肥成為我國農業生產過程中普遍使用的補充氮元素的方法。目前來說，植物生長所需的氮元素大多來自于人工施用的工業氮肥所提供的化合態氮[2]。但是過量的施用化肥容易損壞土壤的結構，造成土壤板結、養分流失等問題，進而影響到植物的正常生長，而且還可能帶來一系列的經濟和社會環境方面的問題，如對水體的富營養化、地下水及居民飲用水受到硝酸鹽的污染等[3]。而固氮菌肥有很好的固氮增肥作用，可以很大程度增加農作物產量，減少土壤污染，對維持耕地生態系統的平衡性意義極大。

1 固氮菌肥的研制

1.1 固氮菌的分離純化

菌株的分離方法采用稀釋平板法[4]：將10.00 g 實驗室土樣放入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，封口后置于水浴恒溫振蕩器中于25℃、200 r/min 條件下振蕩30 min 后，靜置20 min。吸取1 mL 上清液于試管中，加入9 mL 無菌水，置于旋渦混合器上充分振蕩均勻。按照上述步驟，將土壤溶液依次稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6。吸取10-4、10-5、10-6 這三個濃度梯度的土壤稀釋液各100 μL，用無菌涂布棒將菌懸液均勻涂布到阿須貝氏培養基平板上[5]，靜置10 min，倒置于28℃恒溫培養箱中，培養2 d，觀察菌落形態并記錄。每個濃度設置3個重復，另設一組空白對照。

用接種環挑取具有典型固氮菌特征的菌落于LB 瓊脂培養基上，進行平板劃線純化。在28℃的電恒溫培養箱培養2 d后得到固氮菌的單菌落。將營養培養基上生長出的單菌落接種至斜面培養基上，封口后置于冰箱冷藏處中保存備用。

1.2 固氮菌的耐受實驗

通過單因素控制變量法測定固氮菌對鹽濃度、pH 值的耐受程度。

耐鹽實驗：配制NaCl 濃度分別為0%、1%、2%、3%、4%、5%、7%和9%的100 mL LB 肉湯培養基[6]，并接種2%含量的種子液[7]。將不同鹽濃度的培養基置于恒溫振蕩器中，于30℃、180 r/min 的條件下培養3 d。每隔4 h 取樣一次測定其OD600值，記錄數值并繪制出曲線。

耐pH 實驗：配制pH 值分別為5、6、7、8、9 的100 mL LB肉湯培養基，并接種2%含量的種子液。將不同pH 的培養基置于恒溫振蕩器中，于30℃、180 r/min 的條件下培養3 d。每隔12 h取樣一次測定其OD600值，記錄數值并繪制出曲線。

1.3 功能性固氮菌肥載體的選擇

本課題選取了玉米秸稈粉末、發酵牛糞和稻殼三種菌肥載體。三種材料各稱取100 g，121℃條件下在高溫蒸汽滅菌鍋中滅菌2 h。將滅菌后的載體放入超凈工作臺中，加入無菌水混勻，使之達到“手握成團，一觸即散”的狀態[8]。向三種載體中各加入30 mL種子液，使菌液與載體充分混勻，即得到菌肥。將制備好的菌肥放到室溫、陰涼、通風、干燥的地方保存，通過平板涂布法測定不同載體固氮菌肥中的微生物數量，記錄實驗數據并進行比較，從而確定出最佳載體。

1.4 固氮菌肥的制備

稱取5 份滅菌完全的最佳載體各250 g，分別加入5 mL、10 mL、20 mL、30 mL、50 mL 的種子液，通過平板涂布法測定不同添加量的固氮菌肥的微生物數量，記錄實驗數據并進行比較，從而得到最佳菌肥制備條件。

1.5 實驗結果

（1）固氮菌的篩選。本次實驗篩選出一株固氮菌，經16S rDNA 鑒定后初步判斷出該種菌與溶菌屬同屬。其菌落形態為球形、半透明、表面濕潤光滑、稍有隆起。菌落圖見圖1 和圖2。

圖1 固氮菌的純化結果Fig.1 Purification results of nitrogen-fixing bacteria

圖2 固氮菌的分離結果Fig.2 Isolation resultsof nitrogen-fixing bacteria

（2）固氮菌的耐受實驗。固氮菌在不同鹽濃度、不同pH值的環境中培養2 d 后，其OD600值均明顯高于初始值，這表明該固氮菌可以耐受鹽含量為9%以下以及pH 值為5～9 的酸性或堿性環境。且固氮菌在鹽含量為1%～3%的鹽環境中的比空白對照組的OD600值要高，這可能是因為低鹽濃度對固氮菌的生長具有促進作用。固氮菌在pH 值為7 的中性環境中OD600最高，而在pH 值為9 的堿性性環境中OD600偏低，這說明OH-濃度過高時，會抑制微生物的生長和繁殖活動。試驗結果見圖3、圖4。

圖3 不同鹽環境下的生長曲線Fig.3 Growth curves in different salt environments

圖4 不同pH值環境下的生長曲線Fig.4 Growth curves at different pH values

（3）菌肥最佳載體的確定。在前7天時，以玉米秸稈粉末和稻殼為載體的菌肥，其菌落數較多。從第8天開始，以發酵牛糞為載體的菌肥的菌落數量增長幅度變大，且一直保持領先；而以稻殼為載體的菌肥，其菌落數目遠落后于其他組。出現這種情況的主要原因是稻殼以及玉米秸稈粉末的保水性能較差，不能為微生物生長發育提供足夠的水分。而發酵牛糞的有機質含量較高，保水性能較好，可以滿足微生物生長繁殖的需求。所以，制備固氮菌肥的最佳載體為發酵牛糞，試驗結果見圖5。

（4）菌肥最優制備條件的確定。不同濃度梯度菌肥的菌落數量增長趨勢相似，均在第1天時處于較平穩的生長速度，在第20 天之后，載體上的菌落數開始下降。從實驗結果來看，菌肥中的菌落數基本上與菌液的添加量成正比，即接種60 mL 菌液時，微生物數量最多。微生物的數量是判斷菌肥優劣的重要標準，所以本課題中選定的制備菌肥的最佳配比為250 g發酵牛糞載體接種60 mL菌液。試驗結果見圖6。

圖6 添加不同量菌液的菌肥的菌落數變化Fig.6 The change of colony number of bacterial fertilizer with different amount of bacterial liquid

2 功能性固氮菌肥的施用對鹽堿土壤性質的影響

本次試驗土壤是從河北省唐山市曹妃甸采集的濱海鹽堿土，采用五點采樣法進行采樣[9]。土壤的基本性質見表1。

表1 濱海鹽堿土的性質Tab.1 The nature of coastal saline-alkali soil

2.1 功能性固氮菌肥肥效試驗

土壤樣品分兩部分采集，一部分將其置于冰箱降溫保存，用于測定微生物數量；另一部分進行自然風干，并通過2 mm 孔徑篩用于測定土壤的各種理化性質，以便后續進行數據分析。取6份篩分后的鹽堿土壤，每份土壤為1.5 kg。對土樣進行編號，A0、A1、A2、A3、A4、A5分別施加0 g、7.5 g、15 g、22.5 g、30 g、37.5 g功能性固氮菌肥。實驗過程中，每隔3 d取一次樣，測定土壤速效鉀、速效氮、全氮、有機質、有效磷、pH和微生物數量指標。通過分析數據，找出土壤中菌肥的最佳投加比例，在最佳配比的基礎上取樣測定微生物數量。

2.2 實驗結果

2.2.1 固氮菌肥對土壤速效氮及全氮的影響

施加固氮菌肥可以有效增加鹽堿土壤中的速效氮和全氮含量。相比于對照組，1.5 kg 鹽堿土中施加30 g 固氮菌肥時速效氮和全氮含量提升最為顯著。菌肥施加量為37.5 g時，速效氮和全氮的含量反而不是最高的，這可能是因為土壤中的營養元素含量有限，不足以滿足固氮微生物的生長繁殖需要，使得固氮微生物的數量減少，從而導致速效氮和全氮含量的減少。試驗結果見圖7和圖8。

圖7 不同投加量對速效氮含量的影響Fig.7 Effects of different dosages on the content of available nitrogen

圖8 不同投加量對全氮含量的影響Fig.8 Effect of different dosage on total nitrogen content

2.2.2 施用固氮菌肥對土壤其他化學性質的影響

施加固氮菌肥對鹽堿土的pH 值幾乎沒有影響，這說明該菌肥不會破壞土壤本身的酸堿性。而土壤中有機質、有效磷和速效鉀的含量都有一定程度的增加，有機質含量增加了5%～20%；有效磷含量增加了1.5%～4.9%；速效鉀含量增加了1.1%～4.2%。并且每1.5 kg 鹽堿土中添加30 g 固氮菌肥的效果最為顯著。有效磷和速效鉀含量的增加是因為固氮菌在土壤中利用真菌的溶解產物形成類似腐殖質的物質，能增加土壤中解磷菌和解鉀菌的數量和活性，從而使土壤中有效磷的含量增加。試驗結果見圖9～圖12。

圖9 不同投加量對pH值的影響Fig.9 Effect of different dosage on pH value

圖10 不同投加量對有機質含量的影響Fig.10 Effect of different dosage on organic matter content

圖11 不同投加量對有效磷含量的影響Fig.11 Effect of different dosage on the content of available phosphorus

圖12 不同投加量對速效鉀含量的影響Fig.12 Effect of different dosage on the content of available potassium

2.2.3 施用功能性固氮菌肥對土壤微生物數量的影響

鹽堿土壤中施加固氮菌肥前微生物數量為1.45×107個/g，施加固氮菌肥后微生物數量增長到了4.25×107個/g，比未投加菌肥時增加了193.1%。造成這種現象主要原因有兩點：一是固氮菌肥中含有大量的固氮菌，所以施加固氮菌肥后土壤中的微生物會大幅度增加；二是固氮菌在土壤中發揮作用，改善土壤的理化性質，有利于促進土壤中原有的微生物的生長繁殖，從而也會導致微生物數量的增加。

3 總結

本課題篩選出了一株固氮菌，經16S rDNA鑒定確定其屬于溶菌屬。該菌可以在9%以下的鹽環境和pH 值為5～9 的酸性或堿性環境中存活。為制備固氮菌肥，選用了玉米秸稈粉末、發酵牛糞及稻殼三種材料，以菌肥中微生物數目的數量為依據，通過控制變量法確定了最佳菌肥的制備配比為250 g 固氮菌肥添加60 mL 固氮菌液。將該菌肥施加到實際貧瘠土壤中發現，土壤中的速效鉀、速效氮、全氮、有機質和有效磷的含量均有一定程度的提高，且該菌肥對土壤pH 值的影響不大。這說明本課題中制得的固氮菌肥有較好的使用效果，在實際應用中有廣闊的前景。