基于雙發射碳點的熒光探針構建及對水中銅離子的檢測

李如雪，黃明玥，周 硼，段春迎

（大連理工大學 化學學院，遼寧 大連 116024）

1 引 言

銅離子（Cu2+）是人體中一種重要的金屬離子，在許多生理活動中起著重要作用。但過量的Cu2+會促進活性氧的產生，從而導致一些神經退行性疾病，如帕金森病和阿爾茲海默癥等[1]，人體中積累過量的Cu2+還會損傷肝臟和腎臟[2]。基于以上原因，各國對水中Cu2+含量都有嚴格限制，我國新頒布的《生活飲用水衛生標準》（GB 5749-2022）規定Cu2+含量小于1 mg∕L，這比世界衛生組織（WHO）的規定更為嚴格。目前Cu2+的常見測試方法主要有原子吸收分光光度法[3]、比色法[4]、電化學分析法[5]、離子色譜法[6]等，但這些方法通常需要精密的設備、繁瑣的預處理過程和較高測試成本。而熒光法具有靈敏度高、操作簡便等優點，近些年來廣泛用于金屬離子的檢測[7]。因此構建一種低成本、操作簡單的Cu2+檢測體系非常重要。

熒光方法因靈敏度較高常用于微量和痕量物質的檢測。相比于單發射熒光探針[8-10]，比率熒光探針由于具有兩個分辨率良好的發射峰，其熒光強度之比可以有效消除背景干擾[11-13]，從而引起了廣泛的研究與關注。而基于碳點[14]（CDs）的比率熒光探針具有優異的生物相容性、水溶性和多發射能力等優點[15]，是開發比率熒光探針的優良材料[16]。Jalili 等[17]通過將藍光和黃光CDs 封裝到沸石咪唑鹽框架中，合成了雙發射金屬有機框架探針（BYCDs@ZIF-8），并應用于谷胱甘肽的檢測。Liang 等[18]以二水合檸檬酸鈉和三聚氰胺為原料，通過水熱法制備了具有藍色熒光的水溶性碳點（CDs），與羅丹明B 構建了雙發射比率熒光傳感器，對L-Cys 表現出較 高 的 選 擇 性。 Cao 等[19]通 過 將AuNCs 與CDs@SiO2結合，開發了一種比率熒光傳感器，以CDs@SiO2中CDs 的藍色熒光為參考信號，以吸附在SiO2表面的AuNCs 的亮橙黃色熒光為響應信號，實現Cu2+和GSH 的熒光傳感檢測。Peng等[20]選取牛血清白蛋白修飾的藍光碳點（BCDs）和紅色的金納米團簇為兩種發光材料，制備了貴金屬摻雜的熒光探針，實現了對銅離子的比率熒光檢測。目前已報道的比率熒光探針的構建大多都較為復雜，通常引入光穩定性較差的熒光染料或貴金屬元素，因此，開發一種合成簡單、價格便宜、操作便捷的比率熒光檢測方法非常重要。

本文以鄰苯二胺和四硼酸鈉為前驅體，加入1-甲基-3-烯丙基咪唑溴鹽來促進鄰苯二胺和四硼酸鈉的聚合，采用一步水熱法合成了新型雙發射碳點（L-CDs），用于水溶液中Cu2+的比率熒光檢測。該比率熒光探針制備方法簡便，無需復雜的化學修飾，且可用于真實水樣中Cu2+的檢測。

2 實 驗

2.1 試劑和儀器

鄰苯二胺（o-PD）、四硼酸鈉、1-甲基-3-烯丙基咪唑溴鹽、Fe（NO3）2、Ni（NO3）2、Pb（NO3）2、Na2Cr2O7、Zn（NO3）2、Cu（NO3）2、Mg（NO3）2、Cr-（NO3）3、Co（NO3）2、Ca（NO3）2、AgNO3、Al（NO3）3、NaNO3、Cd（NO3）2，所有試劑均購買自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上試劑均未經進一步純化。

樣品形貌的表征采用場發射透射電子顯微鏡F200（日本電子株式會社）。樣品的FT-IR 光譜采用高級傅里葉變換紅外光譜儀IS50（美國賽默飛公司）測試，UV-Vis 光譜采用紫外吸收光譜儀TU-1900（日本高新技術公司）測量，熒光光譜采用穩態瞬態熒光磷光光譜儀FLS1000（英國愛丁堡儀器公司）測得。

2.2 L-CDs 的制備

采用一步水熱法制備了L-CDs。將0.2 g o-PD、0.2 g 四硼酸鈉和0.4 g 1-甲基-3-烯丙基咪唑溴鹽溶解在10 mL 去離子水中，超聲10 min，再將混合液密封在聚四氟乙烯內襯的高壓釜（25 mL）中，并在180 ℃下加熱10 h。自然冷卻后，將所得懸浮液離心，大顆粒通過濾膜（0.22 μm）除去，多余的小分子使用透析袋（500 u）透析24 h 除去，最后冷凍干燥得到L-CDs。將得到的黃色固體避光干燥保存，以便下一步的實驗。

2.3 Cu2+的檢測

為了驗證L-CDs 對不同金屬離子的選擇性，分 別 將50 μmol∕L 的 物 質（Fe（NO3）2、Ni（NO3）2、Pb（NO3）2、Na2Cr2O7、Zn（NO3）2、Cu（NO3）2、Mg-（NO3）2、Cr（NO3）3、Co（NO3）2、AgNO3、Al（NO3）3、NaNO3、Cd（NO3）2等）加 入 到L-CDs 溶 液 中（0.2 mg∕mL，8 mL），在室溫下靜置20 min 后，掃描LCDs 的熒光光譜，觀察L-CDs 溶液的熒光強度變化。進一步研究Cu2+存在下，其他金屬離子對LCDs 的 熒 光 干 擾，在0.2 mg∕mL 的L-CDs 溶 液 和50 μmol∕L Cu2+溶液中加入其他金屬離子（50 μmol∕L），進行抗干擾性實驗。

進一步對L-CDs 進行Cu2+的滴定，在含有LCDs（0.2 mg∕mL）的溶液中，逐漸加入Cu（NO3）2溶液，測量其熒光光譜。實驗在相同條件下重復3 次。

2.4 實際樣品分析

實際樣品選取為自來水和河水，所有水源樣品都從當地獲得。將一定濃度的Cu2+添加到含有L-CDs（0.2 mg∕mL）的水樣中，并記錄熒光光譜，回收率（%）是測試出Cu2+的量與加標樣品的量之比。通過在相同條件下重復實驗3 次獲得相對標準偏差（RSD）。

3 結果與討論

3.1 比率熒光探針構建和結構表征

本文通過一步水熱法構建了比率熒光探針L-CDs，該雙發射熒光探針的制備及對Cu2+的檢測如圖1 所示。以鄰苯二胺和四硼酸鈉為前驅體，在1-甲基-3-烯丙基咪唑溴鹽存在時合成了具有兩種不同發射波長的熒光納米材料。該材料在380 nm 波長激發下顯示出在440 nm 和570 nm 處的雙發射峰，前者在加入Cu2+時熒光逐漸猝滅，而后者的熒光逐漸增強。通過記錄二者的熒光強度比值，可消除非特異性干擾，實現對目標分析物Cu2+的檢測。

圖1 L-CDs 的合成及作為Cu2+熒光傳感器示意圖Fig. 1 Schematic diagram of L-CDs synthesis and L-CDs as Cu2+ fluorescence sensor

L-CDs 的形貌和尺寸采用透射電鏡表征（圖2（a））。從圖中可以看出所制備的L-CDs 為準球形，均勻分散排列[21]，其直徑基本分布在1.8~3.6 nm，平均直徑為2.67 nm（圖2（b））。從HRTEM圖像（圖2（a）插圖）中可以觀察到明顯的晶格條紋，晶格間距為0.21 nm，與石墨碳sp2的衍射平面相吻合。XRD 圖譜中在21.3°附近有較寬的衍射峰，這歸屬于石墨晶體的（002）面[22]，說明L-CDs具有一定的石墨結構（圖2（c））。在拉曼光譜中，1 350 cm-1和1 610 cm-1的特征峰分別代表著D 帶和G 帶，表明L-CDs 除含有sp2雜化外，還存在sp3雜化結構（圖2（d））。

圖2 （a）L-CDs 的TEM 圖 像，插圖：L-CDs 的HRTEM 圖像；（b）L-CDs 的尺 寸 分 布；（c）L-CDs 的XRD 譜；（d）L-CDs 的Raman 光譜；（e）L-CDs 的FT-IR 光譜；（f）L-CDs 的UV-Vis 光譜。Fig. 2 （a）TEM image of L-CDs. Illustration： the HRTEM image of L-CDs. （b）The size distribution of L-CDs. （c）XRD pattern of L-CDs. （d）Raman spectra of L-CDs. （c）FT-IR spectrum of L-CDs. （f）UV-Vis spectrum of L-CDs.

FT-IR 進一步表征了L-CDs 的化學官能團[23]。如圖2（e）所示，3 400 cm-1處的吸收峰是由N—H拉伸振動形成的，在1 500 cm-1的尖銳吸收峰對應于B—O 的伸縮振動，而在2 379 cm-1的吸收峰對應O=C=N—的伸縮振動。從紅外光譜可知，B和N 成功摻雜于L-CDs 中，其表面存在大量的含氮和含氧基團[24]，例如胺基、羥基、羰基和羧基[25]。

3.2 L-CDs 的光學性質

采用UV-Vis 光譜和熒光光譜探究L-CDs 的光學特性。以羅丹明B 為參比物質，根據公式：

其中，YU、YS表示待測物質和參比物質的熒光量子產率，FU、FS表示待測物質和參比物質的積分熒光強度，AU、AS表示待測物質和參比物質在該激發波長的入射光的吸光度，計算L-CDs 的量子產率為6.51%。紫外可見光譜（圖2（f））顯示，L-CDs 在220 nm 和280 nm 處分別有一強吸收帶和弱吸收帶，其中220 nm 處的強吸收源于C=C sp2結構域的π-π*躍遷，280 nm 處的吸收來自于C=N∕C=O 鍵 的n-π*躍 遷，這 表 明L-CDs 具 有 一 定 的 共 軛結構[26]。

利用熒光光譜研究了激發波長在350～420 nm 時L-CDs 的熒光發射現象（圖3）。從圖中可以看出L-CDs 的發射光譜隨激發波長變化，當激發波長從350 nm 增加到390 nm 時，440 nm 處的熒光發射峰逐漸下降并伴有輕微紅移，同時570 nm處的發射峰強度逐漸增加。當激發波長大于400 nm 時，碳點的發射峰主要在570 nm。在380 nm的激發下，L-CDs 顯示出藍、黃雙發射現象（圖S2）。

圖3 L-CDs 的熒光發射光譜Fig. 3 Fluorescence emission spectra of L-CDs

進一步研究了不同外界環境對L-CDs 雙發射熒光的影響。在380 nm 的紫外燈長時間（120 min）照 射 下（圖S3（a）），L-CDs 的 熒 光 強 度 比（F570∕F440）基本保持不變，顯示出了L-CDs 良好的抗光漂白性能。在高濃度的NaCl 溶液中（100 mmol∕L）[27]，F570∕F440的變化也可忽略（圖S3（b））。pH 值的影響如圖S3（c）所示，在pH = 4~11 范圍內，F570∕F440的值較為穩定。但在強酸或強堿溶液中，L-CDs 的 熒 光 強 度 發 生 了 變 化，導 致F570∕F440的比值減小。這可能是由于在強酸或強堿性環境中，L-CDs 表面豐富的氮、氧基團（氨基、羥基等）的質子化和去質子化導致L-CDs 的表面狀態發生了變化，從而影響L-CDs 的熒光。綜上，L-CDs 可以在一定的環境變化中保持穩定，從而為熒光檢測體系的構建提供了基礎。

3.3 L-CDs 對Cu2+的熒光響應

L-CDs 熒光探針的選擇性和抗干擾能力如圖4 所示。大部分金屬離子對L-CDs 熒光幾乎沒有影響（圖4（a））。但Ag+、Cr2O72-和NaClO 較為特殊，Ag+可以使L-CDs 在570 nm 處的熒光猝滅；Cr2O72-由于內濾作用，可以使L-CDs 在440 nm 處的熒光猝滅，從而影響到570 nm 處的熒光強度；NaClO 由于具有漂白性使L-CDs 的熒光猝滅。而經過分析發現，Ag+、Cr2O72-和NaClO 對L-CDs 熒光強度比（F570∕F440）的影響可以忽略不計（圖4（b））。顯然，與單發射探針相比，比率探針可有效排除一些共存物質的影響，顯示出更高的選擇性。

圖4 （a）L-CDs 對一些離子的熒光響應；（b）L-CDs 對一些離子的熒光響應（F570∕F440）；（c）Cu2+存在下L-CDs 對金屬離子的熒光響應；（d）Cu2+存在下L-CDs 對金屬離子的熒光比（F570∕F440）。Fig. 4 （a）Fluorescence response of L-CDs to different ions. （b）Fluorescence response（F570∕F440） of L-CDs to different ions. （c）Fluorescence responses of L-CDs to different metal ions in the presence of Cu2+. （d）Fluorescence response（F570∕F440） of L-CDs to different metal ions in the presence of Cu2+.

L-CDs-Cu2+體系的抗干擾性[28]如圖4（c）所示，當其他常用金屬離子的濃度與Cu2+濃度（50 μmol∕L）相同時，L-CDs 的熒光強度基本保持不變，F570∕F440的比值也沒有明顯變化（圖4（d）），表明這些干擾離子的存在不影響L-CDs 對Cu2+的檢測，所構建的熒光檢測體系具有良好的抗干擾能力，為檢測實際樣品中的Cu2+提供了保證。

為了優化L-CDs 檢測Cu2+的反應條件，研究了L-CDs 初始濃度和pH 對檢測的影響。對于不同初始濃度（0.05，0.10，0.20，0.30，0.40 mg∕mL）的探針（圖S4（a）），在一定濃度的Cu2+溶液中，F570∕F440隨著初始濃度的增加先增大后減小。對于酸和堿對檢測體系的可能影響，引入了不同的pH 值（2~13）（圖S4（b））。當pH 在3~10 之間，酸堿性對檢測體系基本無影響。因此，下文以0.20 mg∕mL 的L-CDs 濃度、pH=7 為反應條件。

進一步研究了探針的熒光強度比與不同濃度的Cu2+溶液（40~244 μmol∕L）的響應之間的關系（圖5）。將一定濃度的Cu2+溶液逐漸滴加到LCDs 水溶液中，可以觀察到，隨著Cu2+濃度從40 μmol∕L 增 加 到244 μmol∕L，L-CDs 在440 nm 處 的熒光發射強度持續下降，同時570 nm 處的發射強度逐漸增強。將熒光信號比（F570∕F440）與Cu2+濃度作圖（圖5 插圖），通過線性擬合, Cu2+濃度在40~244 μmol∕L 范圍內呈良好的線性關系，相關系數R2= 0.995，回 歸 方 程 為F570∕F440= 17.763x-0.3598。通過檢出限（LOD）計算公式：

圖5 L-CDs 對 不 同 濃 度Cu2+（40~244 μmol∕L）的 熒 光 響應，插圖：F570∕F440與Cu2+濃度的線性關系。Fig.5 Fluorescence emission spectra of L-CDs with different Cu2+ concentrations. Illustration： the linear relationship between F570∕F440 and concentrations of Cu2+ranging from 40 to 244 μmol∕L.

其 中，σ表 示 空 白L-CDs 的 標 準 差，S表 示 校 準 曲線的斜率，得出L-CDs 的LOD 為0.61 μmol∕L。與一些已報道的熒光檢測方法相比（表1），本方法在合成過程中避免了貴金屬的使用，在構建比率熒光檢測體系的過程中避免了復雜的比率探針構建。對比有機小分子探針，該探針避免了光漂白且檢測Cu2+的線性范圍較寬等，為比率熒光檢測Cu2+提供了一個新的思路。

表1 與其他熒光檢測Cu2+方法的比較Tab.1 Comparison with other fluorescence methods for detecting Cu2+

3.4 L-CDs 對Cu2+的響應機理

目前，熒光探針和目標物之間的作用機理大致可分為光誘導電子轉移（PET）、內濾作用（IFE）和熒光共振能量轉移（FRET）等[35]。如圖6（a）所示，L-CDs 的Zeta 電位為-13.8 mV，加入Cu2+后整個系統的電位為+11.7 mV，這可能是由于L-CDs表面帶負電，與Cu2+存在一定的靜電作用，從而改變了整個系統的電位。進一步研究所制備的LCDs 和Cu2+之間可能的相互作用機理，研究了其熒光光譜、紫外-可見光譜等。從圖5 中可以看出，在加入Cu2+后，L-CDs 在440 nm 處的熒光逐漸猝滅，而570 nm 處的熒光峰強度逐漸增加，可能存在能量轉移過程。針對該熒光現象，首先研究了相關UV-Vis 光譜。如圖6（b）所示，Cu2+在250 nm 后幾乎沒有紫外吸收，所以與L-CDs 的激發發射光譜基本無重疊。但在L-CDs 溶液中添加Cu2+后，在420 nm 左右出現了一個新的吸收峰，這一新的吸收峰歸因于L-CDs 和Cu2+形成了新的絡合物[17]，而該峰與L-CDs 的發射光譜有重疊（圖6（c）），因此推測L-CDs 的猝 滅可能是由IFE 或FRET 引起的。

圖6 （a）L-CDs、L-CDs+Cu2+的Zeta 電位；（b）Cu2+、L-CDs、L-CDs+Cu2+的UV-Vis 光譜；（c）L-CDs+Cu2+的UV-Vis 光譜和LCDs 的Em 光譜；（d）L-CDs 和L-CDs+Cu2+的熒光壽命衰減曲線。Fig. 6 （a）Zeta potential of L-CDs and L-CDs+Cu2+. （b）UV-Vis spectra of Cu2+，L-CDs and L-CDs+Cu2+. （c）UV-Vis spectra of L-CDs+Cu2+and Em spectra of L-CDs. （d）Fluorescence lifetime attenuation curves of L-CDs and L-CDs+Cu2+.

對于IFE，猝滅劑的存在不會改變熒光分子激發態的壽命[36]。因此，進一步測試了添加Cu2+前后L-CDs 的熒光壽命，以驗證其猝滅機制。熒光壽命衰減曲線如圖6（d）所示，在Cu2+不存在和存在的情況下，熒光壽命分別為6.49 ns 和5.56 ns，即添加Cu2+后熒光壽命發生了明顯變化，表明猝滅機理不可能歸因于IFE，而可能是FRET。從結構上看，由于L-CDs 表面含有—NH2和—BOH，Cu2+可以與L-CDs 配位形成復合物，而且Cu2+和L-CDs 之間的靜電作用有效縮短了LCDs 之間的距離，促進能量轉移的發生。因而使L-CDs 顯示出隨著Cu2+濃度的增加，在440 nm 處的熒光強度減弱、570 nm 處的熒光強度增強并紅移到580 nm 的熒光現象。基于上述實驗結果，L-CDs 與Cu2+的作用機理是復合物的形成和FRET。

3.5 L-CDs 的實際樣品檢測

最后，通過檢測加標水樣（自來水和河水）中的Cu2+，評估了比率熒光探針L-CDs 實際應用的可行性[37]，結果如表2所示。可以觀察到，該方法在自來水中得到的平均回收率在100.40%~101.40%之間，RSD小于3.6%。用同樣的方法檢測河水樣品，得到的回收率在99.39%~101.80%之間，RSD 小于2.6%。這些結果表明比率熒光探針L-CDs 構建的熒光檢測體系有應用于實際樣品中Cu2+分析的可行性。

4 結 論

本文通過一步水熱法成功制備了用于高選擇性檢測Cu2+的比率熒光探針L-CDs，并且熒光檢測體系的構建沒有任何進一步修飾。L-CDs在440 nm 和570 nm 處具有雙發射峰，Cu2+的加入可以使440 nm 處的熒光強度降低、而570 nm處的熒光強度增加。Cu2+濃度在0.04~0.244 mmol∕L 范 圍 內，與 熒 光 信 號（F570∕F440）呈 線 性 相關，LOD 為0.61 μmol∕L。并 且L-CDs 對Cu2+的檢測表現出高選擇性和抗干擾性。將制備的LCDs 應用于真實水樣中Cu2+的測定，表現出良好的回收率。與已報道的Cu2+熒光探針相比，制備的L-CDs 具有成本低、合成簡單、操作方便的優點，為比率熒光的構筑及應用提供了一個新的思路。

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