貴州六盤水地區大葉黃楊葉枯病病原菌鑒定

王瑞仙，田 霜，魯武鋒，方英藝，張孝敬，安傳相，譚 莉，楊友聯

1.鳳岡縣農業農村局，貴州鳳岡 564200；2.六盤水師范學院 生物科學與技術學院，貴州六盤水 553004

大葉黃楊（Euonymus japonicusThumb）具有一定的觀賞價值和生態價值，是園林綠化中的常見植物。由于其葉部病蟲害發生普遍，常造成植株死亡，影響了其在園林綠化中的應用價值。目前，對大葉黃楊白粉病、大葉黃楊褐斑病（葉斑病）和大葉黃楊炭疽病的研究較為深入，病原菌分別為正木粉孢霉（Oidium euonymi-japonicaeSacc）、壞損尾孢（Cercospora destructiveRav）、膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz）[1-2]。但還沒有對大葉黃楊葉枯病病害系統、全面的研究報道。李庚花等[3]研究發現大葉黃楊葉枯病的病原菌為半知菌亞門盤多毛孢屬，而賁海燕[4]發現引起大葉黃楊葉枯病的病原菌為黃楊葉點霉，但該病原菌的形態結構與李庚花等報道的差別較大。上述研究均只采用了形態學鑒定的方法，且研究結果存在爭議。因此，采用新技術手段進一步探索大葉黃楊葉枯病的病原菌，明確大葉黃楊葉部病害種類及其防控策略尤為重要。

研究發現，應用分子生物學技術可更加準確地鑒定病原菌種類，其中因核糖體轉錄間隔區序列（ITS）在眾多基因序列中最容易被擴增及測序，已廣泛應用于病原真菌檢測[5]。但ITS序列拷貝引物位點高度保守，許多復合種不能單一地依靠ITS序列進行區分，且基因片段較短，在真菌系統學研究中存在不足[6]。除ITS外，甘油醛三磷酸脫氫酶基因（GPDH），α、β、γ-微管蛋白基因，鈣調蛋白基因（CAL）等也被廣泛應用于真菌系統學研究[7]。應用多基因分析結合形態學特征可提高真菌的準確識別率，使依靠形態學及單基因分析極難識別的復合種的鑒定成為可能。

近年來，在貴州省六盤水地區發現疑似大葉黃楊葉枯病的癥狀，發病后其葉片病斑呈圓形、多角形或不規則形，后期病斑上有絲狀斑紋，葉面著生黑色分生孢子盤。該病害多危害葉片、嫩梢和幼莖，最終可致使葉片枯死掉落，嚴重時導致全株枯死。該病害存在大范圍流行的趨勢，嚴重影響了大葉黃楊的觀賞及生態價值。為明確引起該病害的病原菌，采用形態學與多基因系統學相結合的方法，對貴州省六盤水地區疑似大葉黃楊葉枯病的病原菌開展研究，旨在確定其分類地位，為該病原真菌的防治奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

在貴州省六盤水市市區及水城縣森林公園采集具典型特征的大葉黃楊葉枯病病害樣品，對病斑進行拍照，裝入牛皮紙信封中。將標本帶回實驗室進行分離純化。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 采用稀釋涂布法分離病原菌，將采集病葉樣品進行純化培養后置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 病原菌形態學鑒定 將分離得到的2個菌株分別接種在PDA平板上，25 ℃恒溫培養倒置培養7 d左右，采用十字交叉法測量菌落直徑，觀察菌落特征。分別刮取病害標本、PDA培養基上的分生孢子堆制成臨時裝片，采用奧林巴斯BX51顯微攝像系統觀察并拍攝分生孢子形態特征，并采用Spot32 v4.0.8軟件測量其大小。

1.2.3 分離菌株的致病性鑒定 參照牛小瑞[8]和楊友聯[9]等的方法，以濃度為3.0×106個孢子/mL的孢子懸浮液為接種體，分別對供試的2個菌株設室內創傷（針刺法）接種和無創傷接種2個處理，用無菌水接種作空白對照。于26 ℃恒溫培養箱中保濕（70%以上）培養。每天觀察記錄發病情況。葉片發病后，從病健交界處分離菌株，完成柯赫氏法則驗證。

1.2.4 多基因聯合鑒定 分別將2個菌株接種于PDA平板上，25 ℃恒溫培養7 d后刮取菌絲，采用改良的CTAB法提取菌株DNA[10]。選擇核糖體轉錄間隔區序列（ITS）、β-微管蛋白（β-tubulin）和翻譯延長因子1α亞基基因（tef-1）3個基因片段作為目標基因進行擴增與測序（表1）。ITS序列引物為ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），β-tubulin序列引物為BT2ATCTT），每個反應體系包括12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix酶，上、下游引物各1 μL，1.5 μL DNA模板和9 μL水，總體積為25 μL。按表2的擴增程序對3個基因片段進行PCR擴增。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，交由成都栢輝生物科技有限公司進行測序。將測序結果在GenBank比對并參考序列相偶聯的文獻，同時下載相似度較高的序列用于序列分析[11-13]（表2）。采用Clustal 1.83對測序的各個基因序列以及在GenBank下載的序列進行比對，比對后各個基因分別首尾相連，采用Paup 4.0 beta 10軟件，最大簡約法（Maximum parsimony，MP）進行分析，以啟發式搜索法（Heuristic Search）構建多基因系統樹，以確定菌株的分類地位。

表2 參與分子系統學分析的序列

2 結果與分析

2.1 供試大葉黃楊病葉的病害癥狀及病原菌初步鑒定結果

病斑多在新生枝葉及頂部葉片處發生，病健交界明顯，病斑呈圓形、多角形或不規則形向外擴展。感病葉片先是變枯黃，后產生黑色小粒點，著生于葉表皮下，后期突破表皮外露，為分生孢子盤和分生孢子，嚴重時整個葉片枯萎（圖1）。

圖1 大葉黃楊葉枯病病癥

圖2 接種供試菌株后大葉黃楊葉片癥狀

分離的菌株純化后得到2個菌株，編號LPSU2015001、LPSU2015002，經鏡檢初步鑒定引起當地大葉黃楊葉枯病的病原菌為擬盤多毛孢屬真菌。

2.2 大葉黃楊病原菌致病性檢測結果

室內接種結果表明，絕大部分健壯的大葉黃楊葉片在刺傷接種后均能被病原菌侵染，且病斑癥狀與供試大葉黃楊病葉相似，而無刺傷接種葉片均未發病，表明該病原菌只能從傷口侵染葉片。2個菌株刺傷接種后發病率均為60%。分離純化后所得菌株菌落及分生孢子形態與原供試菌株一致。

2.3 大葉黃楊病原菌的形態學鑒定

經分離純化，菌株LPSU2015001在PDA培養基上的菌絲呈白色絮狀，生長速度11.1～11.4 mm/d，菌落邊緣不整齊，背面淺黃色，菌絲致密，有同心環狀紋飾（圖3A）；分生孢子堆黑色，分生孢子5細胞，（23.9～30.3）μm×（4.4～7.40）μm，中間3個色胞幾乎同色，上2色胞深褐色，第3色胞顏色稍淡，分割處顏色特深，稍縊縮，頂胞無色，梯形或圓錐形，有2～3根附屬絲，長14.5～29.8 μm，尾孢無色，圓錐形，具中生式柄1～2根，多1根，長6.3～12.8 μm（圖3B、圖3C）。寄主上，分生孢子4～5細胞，4細胞分生孢子無頂端透明孢，多5細胞，直或稍彎曲，（16.9～27.5）μm×（5.9～9.8）μm（圖3D、圖3E）；產孢細胞生于分生孢子梗頂端，棍棒形，無色，末端產分生孢子（圖3F、圖3G）。

圖3 LPSU2015001純培養及顯微特征

菌株LPSU2015002在PDA培養基上菌絲潔白，呈棉絮狀，分布均勻，菌落邊緣不整齊，氣生菌絲少，有同心輪紋，接種點周圍菌絲稍稀疏，生長速率9.7～9.9 mm/d（圖4A）；分生孢子堆黑色，分生孢子5細胞，（20.4～27.6）μm×（4.3～7.8）μm，中間3個色胞幾乎同色，上2色胞深褐色，第3色胞顏色稍淡，分割處顏色特深，稍縊縮，頂胞無色，梯形或圓錐形，有1～2根附屬絲，長9.4～21.4 μm，尾孢無色，圓錐形，具中生式柄1根，長4.8～7.7 μm（圖4B、圖4C）。寄主上，分生孢子4～5細胞，4細胞分生孢子無頂端透明孢，（16.5～36.7）μm×（4.8～9.9）μm，整體較小，具小瘤（圖4D、圖4E）；產孢細胞生于分生孢子梗頂端，棍棒形，無色，末端產分生孢子（圖4F）。

圖4 LPSU2015002純培養及顯微特征

2.4 大葉黃楊病原菌的分子生物學鑒定

將分離得到的2個菌株的ITS、β-tubulin、tef-1序列與從GenBank下載的同源性較高的序列（表2），以最大簡約法，以Seiridium sp. SD096作為外類群，基于ITS、β-tubulin、tef-1序列構建多基因系統樹（圖5）。結果表明，LPSU-2015001與P.intermediaM親緣關系較近，處于同一進化分支上，支持率為93%；LPSU2015002與P.trachicarpicola親緣關系較近，處于同一進化分支上，支持率為79%，但兩者支長差異較大。

圖5 基于ITS、β-tubulin、tef-1部分序列構建的擬盤多毛孢屬系統發育樹

3 討論與結論

大葉黃楊葉枯病是一種常見的植物真菌性病害，早在2006年，李庚花等[3]在對江西省大葉黃楊病害調查中，通過描述病原菌分生孢子大小，分生孢子器著生位置，鑒定該病的病原菌為半知菌亞門盤多毛孢屬，并未對分生孢子及產孢細胞等形態特征作具體描述。賁海燕等在對北方花卉新病害的鑒定中，采用形態學鑒定的方法，描述了大葉黃楊葉枯病病原菌的分生孢子器以及PDA純培養特征與顯微特征，鑒定該病原菌為黃楊葉點霉，但其形態結構與李庚花等報道的差別很大。通過形態學鑒定，2個菌株的形態學特征均與前兩者不同，觀察純培養特征及顯微特征，初步判定2個菌株（LPSU2015001、LPSU2015002）均屬于擬盤多毛孢屬。

有關擬盤多毛孢屬的分類，Steyaert[14]根據分生孢子的形態特征作為界定擬盤多毛孢的依據；Cuba[15]則設5細胞組以界定擬盤多毛孢屬，兩者均根據形態特征來劃分種。但對于形態特征的測量及描述，各學者的研究結果均存在參差，且許多種的形態特征幾乎相似，不同的人可能會將不同的種鑒定成同一個種，甚至會出現形態學與基因分析結果不相吻合的情況[16]。

參照Maharachchikumbura等[17-18]的研究，將分離到的2株菌與其在分子系統發育樹中近緣種的形態特征相比，發現LPSU2015001的形態學特征與Maharachchikumbura等對P. intermedia的描述稍有差異，如寄主上，LPSU2015001分生孢子大小為（16.9～27.5） μm×（5.9～9.8）μm，而Maharachchikumbura等描述的是（24.0～28.0）μm×（5.5～6.5）μm，結合多基因系統發育樹的結果，兩者處于同一進化分支上，支持率為93%，因此可將LPSU2015001鑒定為P. intermedia。基于LPSU2015002多基因系統發育樹的結果，其與P. trachicarpicola親緣關系較近，但兩者的支長相差大，且支持率僅有79%，在形態方面，LPSU2015002寄主上分生孢子較P. trachicarpicola長，頂端附屬絲數量、長度、分生孢子細胞數量等差異較大，故不能將其分類單元定位到種，暫定為Pestalotiopsissp.。因此，此次在六盤水地區采樣分離得到的疑似大葉黃楊葉枯病的病原菌為擬盤多毛孢菌株，其中菌株LPSU2015001為P. intermedia，菌株LPSU2015002暫定為Pestalotiopsissp.。