基于UiO-66-NH2與適配體之間熒光共振能量轉移檢測大米中的鎘離子

程 靜，齊珍麗，許 宙，丁 利，程云輝，陳茂龍

（長沙理工大學食品與生物工程學院，湖南 長沙 410114）

現代工業的迅速發展，引發了一系列的環境問題，包括大氣污染、土壤污染和水源污染等。污染因素種類眾多，其中重金屬鎘污染具有隱蔽性、長期性和累積性等特性[1]，毒害效應短期難以察覺，但是通過食物鏈累積，即使濃度很低，它也能導致人體各種健康問題。如鎘中毒會損害心血管和免疫系統，導致癌癥、糖尿病、腎衰竭、肝功能衰竭，以及心臟病等致命疾病[2]。我國是世界第二大水稻糧食種植國，產量占國內糧食總產量的1/3以上，湖南省是人均大米消費量最高的省份[3]。研究發現水稻、小麥等糧食作物對鎘有一定的富集能力，其中水稻更容易富集鎘[4]，對食用者的身體健康產生較嚴重危害。因此，必須開展對大米中重金屬鎘的檢測研究，這對預防鎘離子（Cd2＋）的傷害具有積極意義。

Cd2＋常用的傳統檢測方法有原子光譜法、電感耦合等離子體質譜法、冷蒸汽原子熒光光譜法和陽極溶出伏安法等，這些都是非常靈敏有效的檢測方法，但價格昂貴且速度慢[5-6]。傳統的檢測方法已經無法滿足社會的日常檢測需求。本研究的目的是要創建一種更加簡便、靈敏、準確、特異性強并方便實踐應用的Cd2＋實時傳感分析方法，對滿足當今日益增長的生產生活需要有較大意義。

近年來，熒光生物傳感器由于其方便快捷、靈敏度高、選擇性好等優點[7]，引起了科學家的極大興趣。本研究在此基礎上開發一種以金屬有機框架（metal-organic frameworks，MOFs）為熒光猝滅劑的新型熒光生物傳感器。MOFs由于其多孔骨架結構[8]、可調節孔徑[9]、比表面積大和良好的化學穩定性[10-11]，在生物傳感器[12]、生物醫學[13]、電催化[14]、能量存儲和轉化[15]等領域得到了廣泛的應用。特別是當它們與適配體功能化結合時，MOFs可用于構建高性能的生物傳感器，應用范圍從醫療診斷[16]、食品安全檢測[17]到環境監測[18]。MOFs的均勻晶體結構、高比表面積及可調的孔結構，允許多種DNA、RNA和適配體附著或修飾，從而構建基于MOFs作為能量受體的熒光共振能量轉移傳感器。

本實驗將MOFs中水穩定分散的UiO-66-NH2作為熒光猝滅劑，利用其較大的比表面積和孔隙率，通過熒光共振能量轉移猝滅熒光標記的適配體，再利用Cd2＋與適配體的特異性相互作用，恢復熒光，以此構建一款Cd2＋熒光傳感器，方法原理如圖1所示。此方法構建的Cd2＋熒光生物傳感器具有簡便易行、靈敏度較高、特異性強的優點。

圖1 UiO-66-NH2/適配體生物傳感器檢測Cd2＋的原理圖Fig.1 Schematic diagram of UiO-66-NH2/aptamer biosensor for detecting Cd2+

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基對苯二甲酸、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸、無水乙醇、九水合硝酸鋁、六水合氯化鎂、四水合乙酸鈷、四水合乙酸鎳、四水合硝酸鎘、氯化鈉、氯化鉀、溴化鉀國藥集團化學試劑有限公司；四氯化鋯 北京百靈威科技有限公司；二水合氯化鈣、四水合氯化亞鐵、三水合乙酸鉛、五水合硫酸銅 西隴化工股份有限公司；六水合三氯化鐵 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所有化學試劑均為分析純。

熒光基團修飾的適配體 生工生物工程（上海）股份有限公司。適配體序列[19]：5’-6-FAM-CTC AGG ACG ACGGGT TCA CAG TCC GTT GTC-3’。

1.2 儀器與設備

Nicolet 670傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司；F96PRO熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司；Rigaku Smartlab 9粉末X射線衍射（powder X-ray diffraction，PXRD）儀 日本理學株式會社；Quanta 400 FEG高分辨熱場發射掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；Zetasizer nano激光粒度儀 英國Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 材料的制備

根據文獻[20]的方法合成UiO-66-NH2；根據文獻[21]的方法合成ZIF-8。

MIL-101合成根據文獻[22]方法，并進行一定修改。將Cr(NO3)3·9H2O、對苯二甲酸、HF、超純水混勻并超聲15 min，最后均溶于100 mL反應釜中，于220 ℃烘箱中反應12 h。冷卻離心（6000 r/min，8 min），并且用超純水、乙醇洗滌，70 ℃真空干燥過夜，得到淺綠色的粉末。

適配體溶液母液的配制：適配體開蓋前先離心（4000 r/min，30～60 s），每吸光度的引物加33 μL的Tris-HCl（pH 7.42）緩沖液配制成100 μmol/L貯存液，混勻后-20 ℃冷藏待用。

1.3.2 檢測條件的優化

在完整的檢測體系下，適配體濃度分別設置為0.1、0.2、0.3 μmol/L和0.4 μmol/L，根據熒光強度選擇合適的適配體濃度。并且在不加入目標物Cd2＋的條件下，UiO-66-NH2的終質量濃度分別設置為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mg/mL和1.0 mg/mL，通過測定518 nm波長處熒光的猝滅強度，以確定最適UiO-66-NH2濃度。根據已報道文獻將所使用的NaCl濃度設置區間在80～150 mmol/L之間，考察在不同濃度下熒光恢復強度。設置不同的孵育溫度（4、15、25、37 ℃）和孵育時間（10、20、40、60、80、100、120 min），以探究目標物在不同溫度和不同時間下與適配體結合后熒光恢復情況。

1.3.3 檢測方法的建立

通過Cd2＋適配體和UiO-66-NH2納米顆粒通過配位結合制備UiO-66-NH2納米顆粒Cd2＋傳感器。適配體溶液稀釋至2.0 μmol/L，貯存在4 ℃的冰箱以待后續使用，將100 μL濃度為2.0 μmol/L的Cd2＋適配體添加到質量濃度為0.2 mg/mL的UiO-66-NH2納米顆粒中，混合均勻，并在室溫下孵育0.5 h。然后將混合物離心（2000 r/min、1 min）以從混合物中除去未結合的適配體，最后將UiO-66-NH2/適配體傳感器分散在緩沖液中。

配制不同濃度的Cd2＋標準溶液（pH 7.4），并儲存在4 ℃冰箱中。加入100 μL 2.0 mg/mL UiO-66-NH2溶液，加入100 μL不同濃度的Cd2＋適配體標準液，加入700 μL Tris-HCl（pH 7.42）緩沖溶液后混勻，25 ℃孵育100 min后，然后測定樣品的熒光強度（適配體終濃度200 nmol/L，UiO-66-NH2終質量濃度0.2 mg/mL）。

熒光檢測條件為微量石英比色皿，激發波長480 nm，發射波長500～700 nm，掃描速率1000 nm/min，狹縫寬度10 nm。

1.3.4 實際樣品檢測

水樣的前處理：取自來水水樣，采集完后用0.22 μmol/L的水系濾膜過濾，然后用火焰原子吸收光譜測其Cd2＋含量，用1%硝酸溶液酸化，置于干凈的容量瓶中，4 ℃冰箱冷藏待用。

大米樣品的前處理：鎘測定參考GB 5009.15-2014《食品中鎘的測定》。

加標樣的制備：向25.0 mL處理后的自來水和大米樣中分別加入Cd2＋標準溶液，得到終濃度為50、500 nmol/L的Cd2＋待檢測樣品。

2 結果與分析

2.1 材料的篩選

首先選擇3 種不同金屬中心構成的MOFs，通過測定UiO-66-NH2、MIL-101（Cr）、ZIF-8三款材料的粒徑和電荷性質。如圖2所示，最終選擇粒徑適宜、帶正電荷數值更大的UiO-66-NH2開展后續檢測研究。

圖2 MIL-101（Cr）、ZIF-8、UiO-66-NH2的總粒徑（a）和總電位（b）圖Fig.2 Total particle size (a) and total potential (b) of MIL-101(Cr),ZIF-8,and UiO-66-NH2

2.2 材料的結構表征

通過紅外光譜（圖3a）可以確定金屬與配體已經完全配位，對比已報道的文獻[23]，—NH2特征振動峰群出現在3471 cm-1和3350 cm-1，在1656、1579 cm-1顯示羧基與Zr的配位，說明UiO-66-NH2材料的合成成功。如圖3b所示，考察UiO-66-NH2的孔徑大小和BET比表面積（約為513 m2/g）。為觀察UiO-66-NH2的形貌，通過掃描電鏡對樣品進行觀察（圖3c）表明，UiO-66-NH2具有較好的八面體結構，結合PXRD圖可以說明UiO-66-NH2的成功合成。UiO-66-NH2單晶模擬的PXRD峰形與實際合成的PXRD峰形（圖3d），主要的衍射峰位置都保持一致且較尖銳，表明材料合成成功且結晶性好。

圖3 UiO-66-NH2的紅外光譜圖（a）、N2吸附等溫線圖（77 K）（b）、掃描電鏡圖（c）和PXRD圖（d）Fig.3 IR spectrum (a),N2 adsorption isotherm (77 K) (b),scanning electron micrograph (c) and power X-ray diffraction pattern (d) of UiO-66-NH2

2.3 傳感體系的構建

由于6-FAM標記的熒光適配體帶負電荷，為驗證適配體成功吸附在UiO-66-NH2上，通過測定混合體系以及UiO-66-NH2的粒徑和電位變化（圖4），發現UiO-66-NH2與適配體在緩沖溶液中結合后，適配體的負電荷會與UiO-66-NH2的正電荷相互抵消，電位從8.56 mV降低至1.01 mV，粒徑從332 nm增加至377 nm。水合粒徑增大及電位變小說明適配體已經成功吸附至UiO-66-NH2上，表明UiO-66-NH2/適配體傳感體系構建成功。

圖4 UiO-66-NH2和UiO-66-NH2/適配體的粒徑（a）和電位（b）變化圖Fig.4 Changes in particle size (a) and potential (b) of UiO-66-NH2 and UiO-66-NH2/aptamer

2.4 檢測條件的優化

在利用熒光標記適配體與UiO-66-NH2構建傳感器時，根據其實驗原理，發現UiO-66-NH2濃度、適配體濃度、鹽濃度等對熒光強度都有較大的影響。因此對反應條件進行優化，以確定獲得最佳檢測性能。主要包括適配體濃度、UiO-66-NH2質量濃度、鹽濃度、孵育溫度與時間。

2.4.1 適配體濃度的優化

因此本研究測定100、200、300 nmol/L和400 nmol/L濃度下適配體的熒光強度，如圖5所示，隨著濃度的增加，熒光強度也隨之增強。雖然熒光強度越高，越符合檢測條件，但是過高的熒光則會減弱低濃度Cd2＋的熒光恢復水平，且需要用的適配體量就會隨之增大，成本就會增加。因此，選擇200 nmol/L作為適配體最終濃度。

圖5 不同濃度下的適配體熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of aptamers at different concentrations

2.4.2 UiO-66-NH2質量濃度的優化

MOFs作為檢測體系的熒光猝滅劑，UiO-66-NH2質量濃度的選擇也有著至關重要的作用。如圖6所示，UiO-66-NH2質量濃度越大，猝滅熒光適配體的效果越強。因此可以確定在518 nm波長處熒光基本消失時為最適UiO-66-NH2質量濃度，所以選擇0.2 mg/mL為UiO-66-NH2最終質量濃度。

圖6 不同質量濃度UiO-66-NH2猝滅適配體熒光光譜（a）和熒光強度變化（b）圖Fig.6 Fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity change (b) of UiO-66-NH2-quenching aptamer at different concentrations

2.4.3 NaCl濃度的優化

Na＋可以中和適配體的電荷，減少其靜電斥力[24]。因此，NaCl的加入有利于適配體與Cd2＋之間形成特定的空間結構[25]。本實驗研究傳感體系中的離子強度與熒光強度之間的關系。如圖7所示，傳感體系的熒光強度在100 mmol/L時出現最高值。隨著NaCl濃度的增加，熒光強度下降，說明Na＋濃度過高會阻礙Cd2＋與適配體的結合，不利于熒光的恢復。因此，選擇含有100 mmol/L的NaCl Tris-HCl開展后續實驗。

圖7 不同濃度NaCl孵育條件下傳感體系的熒光光譜（a）和熒光強度變化（b）圖Fig.7 Fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity change (b) ofthe sensor system under different concentrations of NaCl

2.4.4 孵育溫度的優化

溫度不同會影響適配體與目標物Cd2＋的結合，進而影響傳感體系中熒光的恢復值[26]，如圖8所示，考察在4、15、25 ℃和37 ℃條件下的熒光恢復強度，發現在25 ℃的熒光恢復最好，4 ℃熒光強度恢復最差。主要原因在于25 ℃適配體與目標物Cd2＋的結合效果最好，這區別于已經報道的相關文獻[27-28]，可能原因在于UiO-66-NH2本身具有一定的孔徑和吸附能力，溫度越高，吸附能力越強。因此選擇25 ℃作為最后的孵育溫度。

圖8 不同溫度孵育條件下傳感體系的熒光光譜（a）和熒光強度變化（b）圖Fig.8 Fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity change (b) of the sensor system at different incubation temperatures

2.4.5 孵育時間的優化

孵育時間是特定空間結構形成寡核苷酸適配體和帽子之間的主要影響因素[29]。如圖9所示，熒光強度隨著孵育時間10～100 min的增加而增強，然后100～120 min趨于平穩。結果表明100 min作為最終孵育時間，熒光恢復效果最好。

圖9 不同孵育時間下傳感體系的熒光光譜（a）和熒光強度變化（b）圖Fig.9 Fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity change (b) of the sensor system at different incubation times

2.5 傳感體系對Cd2＋檢測的性能分析

記錄不同濃度Cd2＋的熒光發射光譜，結果如圖10所示，傳感體系的熒光強度隨著Cd2＋濃度的增加而逐漸增大。在10～10000 nmol/L范圍內，傳感體系的熒光強度與Cd2＋濃度呈良好的線性關系，相關系數R2=0.977。該方法所得檢出限為：

圖10 加入不同濃度Cd2＋后的熒光光譜圖Fig.10 Fluorescence spectra of the sensor at different Cd2+ concentrations

式中：Y為518 nm波長處的熒光強度；X為Cd2＋濃度；Sb為測定20 次空白實驗后的方差；K為式（1）中斜率；LOD為檢出限，計算得為0.107 nmol/L。由于重金屬Cd2＋的特性與嚴重危害力，與其他生物小分子相比，Cd2＋與適配體結合的作用力相對更弱。對比已經報道的熒光傳感器，線性范圍較大，檢出限較低，具有一定的優勢（表1）。

表1 Cd2＋檢測方法的比較Table 1 Comparison of this method with other methods for detecting cadmium ion

2.6 金屬離子檢測特異性分析

由于實際檢測中往往是多種金屬離子共同存在，對于離子探測材料來說，其探測的抗干擾性也會受到影響，為了排除其他離子對檢測的影響，本實驗考察在其他金屬離子作用下，傳感體系的選擇能力。如圖11所示，在Al3＋、Ca2＋、Co2＋、Cu2＋、Fe2＋、K＋、Mg2＋、Na＋、Ni2＋、Pb2＋、Zn2＋和Fe3＋存在的情況下，傳感體系的熒光基本無變化，表明該傳感體系對Cd2＋具有較好的選擇特異性。

圖11 熒光檢測Cd2＋選擇性實驗Fig.11 Selectivity for fluorescence detection of Cd2+

2.7 實際樣品中Cd2＋的檢測

為驗證本研究方法的實用性，通過對自來水和大米樣品中分別添加50 nmol/L和500 nmol/L的Cd2＋標準溶液，進行加標回收實驗，通過計算統計得到的結果如表2所示。大米樣品中加標回收率略高于水樣，可能是由于實際的樣品中大米中的Cd2＋不僅存在于表面也存在于大米顆粒內部[34]。加標回收率在91.14%～107.98%之間。結果證明，本研究構建的熒光傳感器可以用作實際樣品中Cd2＋的檢測。

表2 傳感體系對實際樣品中Cd2＋的檢測Table 2 Results of detection of Cd2+ in actual samples by the sensor system

3 結論

本實驗利用UiO-66-NH2材料與Cd2＋適配體構建了一款Cd2＋熒光生物傳感器，最優條件下，在0.01～10 μmol/L范圍內，傳感體系的熒光強度與Cd2＋濃度呈良好的線性關系；該生物傳感器對Cd2＋具有良好的選擇特異性，并能對實際樣品水和大米中的Cd2＋有較好的檢出能力。本方法較經濟、簡便易行，為重金屬Cd2＋的檢測提供了新方法。更重要的意義在于通過更換適配體序列即可方便構建出其他重金屬離子的檢測方法，值得擴展研究。