基于低場核磁-近紅外二維相關光譜技術研究加熱溫度對牛肉水分的影響

王廷敏,謝安國,2,付淑亞,劉云宏*

1(河南科技大學 食品與生物工程學院,河南 洛陽,471023) 2(南陽理工學院 張仲景國醫國藥學院,河南 南陽,473004)

牛肉作為一種具有較高營養價值的保健型肉類食品,在我國的消費量僅次于豬肉和禽肉[1]。牛肉中蛋白質含量達到了20%左右,并含有人體所需的所有必需氨基酸[2]。牛肉經過熱加工處理后,其所含的蛋白質會發生變性、降解,脂肪也會因為氧化反應產生相應變化,水分含量和分布情況也會發生較大改變,進而影響牛肉的品質[3]。肉制品生產加工中,按滅菌溫度的高低可分為高溫肉制品和低溫肉制品。高溫肉制品是指加熱殺菌時食品中心溫度大于115 ℃并持續一段時間,滅菌徹底,因而商品貨架期長。低溫肉制品是采用較低的殺菌溫度進行巴氏殺菌的肉制品,肉制品中心溫度達到68～72 ℃時可保溫30 min左右,能夠較好地保留原有的風味物質和營養成分。因此不同加熱溫度在肉品工業中都有合適的應用場景。

水分的組成和分布是牛肉肌肉的一個重要質量指標,對牛肉的質構、色澤和商業價值有顯著的影響。低場核磁共振技術(low-field nuclear magnetic resonance,LF-NMR)可以用來研究牛肉的水分遷移情況,它作為一種快速發展的新興技術,在肉及肉類產品的檢測中已經得到廣泛的應用[4]。通常認為肉品弛豫特征峰能夠反映肉中不同水分狀態的分布情況,趙家藝等[5]研究發現醬鹵牛肉的質構特性及水分變化與二次加熱溫度呈規律性變化。馬紀兵等[6]研究牦牛肉在風干過程中水分遷移規律,探討了核磁參數與組織結構和質構之間的相關性,結果發現隨著風干時間的延長,肌原纖維橫截面積、肌纖維直徑以及肌間距離顯著降低,牦牛肉的硬度、內聚性、膠著性、咀嚼性則顯著增大。

光譜分析檢測技術具有較高的靈敏度、其選擇性很強,能夠實現無損、快速地檢測樣品,通常作為一種快速評估肉類化學成分的技術。如今,近紅外(near-infrared,NIR)光譜已成功應用于牛肉行業化學成分的測量例如,它被用來測定牛肉成分和質量特性[7]。此外,光譜分析技術還被用于牛肉和豬肉的揮發性鹽基氮的含量測定[8];結合化學計量學方法定量鑒定牛肉肉糜摻假情況[9-10]。然而,近紅外光譜數據龐大,光譜信息復雜,不同結構信息的圖譜重疊嚴重,限制了光譜進一步分析。二維相關分析可將傳統的一維光譜擴展到二維,能提高光譜的分辨率和重疊峰的分離度[11-12]。而移動窗口技術[13-14]可以觀察出官能團隨外界干擾發生變化的時間段,能夠將物質的靜態檢測轉變為動態分析,明顯的對比出不同溫度對肉品的影響。核磁共振反映的是氫質子的運動狀態,而近紅外光譜反映了含H鍵官能團的分子振動狀態。2種獨立的技術從不同維度上反映了水分子的結構與狀態,起到了相互補充,相互印證的作用。將核磁、近紅外與移動窗口二維光譜技術相結合,在解決不同官能團重疊、準確識別光譜信號變化的同時,還能確定官能團發生變化的時序以及官能團與不同分子水的相似來源。

近年來,利用低場核磁或近紅外研究牛肉加工方面已有文獻報道,但未見將核磁、近紅外與移動窗口二維相關光譜技術相結合應用于食品領域的相關研究。本研究從分子層面出發,利用現代光譜技術依次從紅外譜、二維相關譜、近紅外-核磁異質譜圖逐級對牛肉熟化過程進行動態跟蹤。通過分析譜圖特征峰變化趨勢和規律,探討不同加熱溫度對牛肉水分狀態的影響,揭示牛肉熟化過程中的結構變化機理,確定各種官能團的變化時序,為牛肉熟化機制研究提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗樣品:牛肉里脊(河南,洛陽,優品生鮮超市)。

1.2 儀器與設備

JA5003B型電子分析天平,上海精科儀器有限公司;DHG9425A型鼓風干燥箱,上海恒科學儀器公司DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,河南省予華儀器有限公司;MINI20-015V-I型低場核磁共振成像分析儀,上海紐邁電子科技有限公司;Brucker Vector 33型傅立葉變換紅外光譜儀,德國BRUCKER公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 試驗設計

將所購買的新鮮牛里脊肉剝去表面的筋膜和脂肪,肉樣切割為4 cm×4 cm×2 cm的牛肉塊,并將其分裝于食品級蒸煮袋中,最后將樣品置于不同加熱溫度(60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120 ℃)的油浴鍋中加熱。分別測定其水分分布狀況,各指標重復測定3次,分析牛肉在熱加工過程中水分遷移規律。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 水分分布的測定

取每個樣品中心位置約1 g的牛肉條分別裝入直徑為15 mm的核磁專用瓶內,將核磁瓶放置于磁體永久磁場中心位置。在肉樣測定之前,首先利用分析軟件FID(free induction decay)脈沖序列對系統參數進行校正,再利用CPMG(carr-purcell-meiboom-gill)脈沖序列采集樣品橫向弛豫時間(T2),重復測定3次。主要參數設置為:SF(MHz)=21,O1(Hz)=305 957.14,P90(μs)=13.00,P180(μs)=26.00,TD=74 990,PRG=1,TW(ms)=1 000.000,TE(ms)=0.250,NECH=3 000,SW(kHz)=100,RFD(ms)=0.080。

1.3.2.2 近紅外光譜采集

通過傅立葉變換近紅外光譜儀采集牛肉熱加工過程中的光譜。采集光譜范圍:10 000～4 000 cm-1(780～2 500 nm);掃描次數:64次;分辨率:8 cm-1。每個樣品采集光譜3次,取平均光譜。

1.4 數據分析

每組實驗數據重復測定3次,取平均值,采用SPSS 21.0軟件完成數據統計,采用Origin 8.0軟件繪圖,在2D shige軟件上進行二維相關分析。

2 結果與分析

2.1 不同加熱溫度下的牛肉橫向弛豫圖譜

牛肉在加熱過程中蛋白質發生變性,進而產生一系列物理特性的變化,這會影響牛肉的水分分布情況。通過低場核磁共振的橫向弛豫時間(T2)分析了牛肉加熱過程中3種組分水的變化。圖1是在不同加熱溫度下加熱一定時間后牛肉的LF-NMR多組分弛豫圖譜。

a-3 min;b-15 min圖1 不同加熱溫度下加熱3 min、15 min的牛肉T2分布圖Fig.1 Distribution of beef T2at different heating temperatures for 3 min and 15 min

T2橫向弛豫時間H質子自旋核在外加磁場收到射頻脈沖的激發后,系統內部達到橫向熱平衡所需要的時間,其值越大反映水分子的流動性越強[15]。肉品在熟化過程中,核磁峰面積和峰形狀都發生了顯著變化。由圖1可見,弛豫時間圖譜出現3個核磁峰,從左至右分別對應:結合水1～10 ms(T21)、不易流動水10～100 ms(T22)、自由水100～1 000 ms(T23)。根據峰積分面積及其變化可知不同組分水的含量及遷移情況。T21表示的是一種存在于細胞內與大分子物質緊密結合的水,結構比較穩定。由圖1可以看出,熱加工過程中T21變化很少。T22代表不易流動水,又稱半結合水,主要分布于肌原纖維及細胞膜之間。圖1中T22峰峰面積、信號強度最大,說明牛肉中水分主要以不易流動水狀態存在。隨著加熱溫度升高,T22峰的峰高顯著降低并且T22峰逐漸變寬;說明有一部分不易流動水會轉化為游離的自由水。加熱溫度越高及加熱時間越長,T22下降得越多。T23表示存在于細胞外間隙的水分,而鮮肉中沒有自由水,隨著加熱溫度不斷升高,加熱時間逐漸延長,自由水含量顯著升高。結合水被看作是一種以氫鍵的形式與肌肉固形物相結合的強極性基團形成的單分子層水,半結合水是親水基團周圍的多層水及鄰近水。蛋白質變性后,其特有的空間結構發生改變,局部呈現出不規則的線狀結構[16]。環繞肽鏈周圍單層水和多層水的形態也會發生變化。因此,3個核磁峰向左移動、馳豫時間都變短,這是由蛋白質和水分子之間的平均間距縮短所致。而牛肉在新鮮狀態下及較低加熱溫度加熱初期不存在T23峰,在80 ℃加熱3 min的條件下,開始出現T23峰。并隨著加熱溫度的升高,不易流動水向自由水轉換的速率變快。

2.2 牛肉熟化過程中的近紅外光譜分析

利用近紅外光譜結合二維相關光譜研究牛肉熟化過程中的變化機理。由圖2可知,不同加熱溫度下的牛肉光譜與鮮樣相比出現顯著的改變,如890、945、1 430、1 750、2 070 nm處反射值明顯增大,鮮肉經熱加工處理后出現原先沒有的波峰,并且波峰和波谷都向長波方向移動。造成這些差異的原因是,牛肉在經過熱加工處理之后,蛋白質熱變性,其中的分子間作用力發生了改變,主要是氫鍵的含量發生了顯著變化。當近紅外光照射在樣品上,樣品內的含氫基團會選擇性地吸收部分特定頻率的近紅外光,加熱處理影響官能團中的O—H、C—H、N—H、S—H的基團振動特征改變,代表相關的分子結構發生變化[17]。

圖2 牛肉不同加熱溫度下加熱的原始近紅外光譜Fig.2 Raw NIR spectra of beef heated at different heating temperatures

2.3 牛肉熟化過程中的二維近紅外相關光譜分析

二維相關紅外光譜技術將一維的近紅外光譜在二維上展開,可以將重疊的小峰和弱峰清晰地顯示出來,提高光譜的分辨率。同時該技術還能將官能團在外界干擾作用下的變化順序在圖中清楚地反映出來,從而有助于對牛肉肌肉熟化機理的研究。二維相關光譜中,在對角線上的峰為自動峰,總是正值;對角線外的峰為交叉峰,分為正交叉峰和負交叉峰。另外,圖中顯示區域,紅色為正峰,藍色為負峰[18]。

圖3-a和圖3-b為牛肉熟化過程中近紅外光譜經二維相關分析得到的同步和異步譜圖,不同加熱溫度的牛肉同步二維紅外相關光譜主要在945 nm/945 nm、1 430 nm/1 430 nm附近出現了2個自相關峰,其峰強度依次為945 nm/945 nm>1 430 nm/1 430 nm,這2個自相關峰都是水分在近紅外波段的吸收帶,分別為O—H的四倍頻振動和二倍頻振動[19-20]。同時,在對角線外出現交叉峰,在890 nm/1 380 nm、1 380 nm/890 nm處出現正交叉峰,而890和1 380 nm處都是C—H伸縮振動,說明自相關峰光譜強度與牛肉熟度之間呈正相關[21]。此外還存在6個負交叉峰:945 nm/2 070 nm、2 070 nm/945 nm、1 430 nm/2 070 nm、2 070 nm/1 430 nm、1 750 nm/2 070 nm、2 070 nm/1 750 nm處,1750和2 070 nm處分別歸屬于S—H二倍頻振動和N—H彎曲振動(稱為酰胺II帶),說明與牛肉熟度呈負相關。在圖3-b中只檢測到交叉峰,有4個正交叉峰,分別在890 nm/1 200 nm、890 nm/1 430 nm、890 nm/1 670 nm和890 nm/2 070 nm處。其強度依次為890 nm/1 430 nm>890 nm/1 200 nm>890 nm/1 670 nm>890 nm/2 070 nm。另外還有4個負交叉峰,分別在1 670 nm/890 nm、1 430 nm/860 nm、1 200 nm/890 nm和2 070 nm/890 nm處。根據Noda[22-23]規則,可以推斷出牛肉熟化過程中不同官能團的變化時序為945 nm>890 nm>1 430 nm>2 070 nm>1 750 nm,即氫鍵變化時序為O—H→C—H→N—H→S—H。

a-同步二維近紅外相關光譜圖;b-異步二維近紅外相關光譜圖圖3 不同加熱溫度下牛肉的同步和異步二維近紅外相關光譜圖Fig.3 Synchronous and asynchronous 2D NIR spectra of beef at different heating temperatures

2.4 近紅外-核磁異質譜圖分析

二維異質相關光譜常被用于檢測2種不同光譜的共變特征。正相關說明2種不同光譜強度變化一致或存在相似來源。為深入探討牛肉熟化過程中的官能團和水分變化的關系,得到了NIR光譜與核磁共振波譜之間的異質二維相關光譜圖。

如圖4-a異質相關譜圖同步圖所示,核磁馳豫時間大于100 ms的T23與NIR的1 430、1 685與2 050 nm附近形成3個較明顯的正相關峰,表明合頻O—H、二倍頻C—H、二倍頻O—H與自由水有相似來源;在圖4-b異步圖中,T23與NIR的945、1 430 nm附近有2個明顯的正相關峰,四倍頻O—H、合頻O—H與自由水有相似來源,并且四倍頻O—H比合頻O—H優先變化;同時在這幾處位置與T22附近同樣有相應的負相關峰,說明加熱使牛肉細胞內O—H、C—H等處的分子結構發生變化,牛肉細胞空間結構被破壞,細胞保水性變差,不易流動水不斷向自由水轉化并逐漸溢出細胞。

a-同步譜圖;b-異步譜圖圖4 二維NIR/NMR異質相關光譜圖Fig.4 Two-dimensional NIR/NMR heterogeneous correlation spectrum

2.5 牛肉熟化過程移動窗口二維相關光譜分析

擾動相關移動窗二維(perturbation related moving window 2D,PCMW2D)分析[24]將動態光譜變量與窗口大小為(2m+1)的子數據集中的動態擾動變量相關聯。通過在整個擾動區域上移動窗口位置并計算每個窗口的相關函數,繪制映射譜圖,就能獲得沿擾動方向的光譜變化信息。此后Thomas等進一步發展了移動窗二維(moving window two dimensional,MW2D)相關光譜技術,2DCOS能夠清晰地給出光譜變量之間的相關性和變化順序。

采用移動窗口技術進一步揭示牛肉熟化過程中物質成分的變化過程,結果如圖5所示。由圖5-a中可以看出,牛肉加熱3 min時,在945、1 430和1 750 nm處出現強的紅外光譜峰,3個光譜峰分別是O—H四倍頻振動,O—H二倍頻振動和S—H二倍頻振動。在加熱時間延長至15 min時,同樣的位置也出現了波譜峰,但其強度明顯低于加熱3 min時的波譜峰強度。在移動窗口H核磁共振譜圖中,牛肉在加熱初期(3 min),在加熱溫度70 ℃處出現2個核磁波譜峰,其波譜峰強度為55δ>65δ,兩波譜峰分別代表半結合水和自由水,表明加熱初期半結合水比自由水變化強度大;在加熱后期(15 min)同樣的化學位移處出現2個核磁波譜峰,但自由水的變化強度明顯高于半結合水。根據Nada的二維光譜理論,自動峰的圓圈數越多,待測體系受外擾變化強度越大。上述結果說明,當溫度達到70 ℃后,牛肉分子結構開始發生變化,分子間的氫鍵大量斷裂,水溶性蛋白質開始凝固,牛肉細胞的保水性逐漸變差,細胞內的水分慢慢遷移到肉品的表面。80 ℃以后,由于對熱敏感的分子結構已被改變,其他物質結構保持了相對穩定、變化緩慢。直到溫度達到105 ℃左右,牛肉的近紅外光譜和核磁譜又開始劇烈變化,在945和1 430 nm處又出現 2個 紅外光譜峰,該峰分別是O—H四倍頻振動和O—H二倍頻振動。T23峰位置左移,游離水中H質子弛豫時間縮短。說明100 ℃ 以上的高溫進一步破壞牛肉物質的分子結構。大量無序卷曲形成和大量疏水鍵暴露,導致肽鏈與水分子形成氫鍵的類型增加,蛋白質和水分子之間的平均間距縮短。110 ℃以后,物質結構的變化再次趨于緩和。高溫對牛肉的影響將主要通過時間累積完成,這一發現與高溫肉制品殺菌過程的經驗認知相一致。

a-3 min移動窗口近紅外光譜;b-15 min移動窗口近紅外光譜;c-3 min H核磁共振譜;d-15 min H核磁共振譜圖5 不同加熱溫度下牛肉的移動窗口近紅外光譜和H核磁共振譜Fig.5 Moving window near-infrared spectra and H NMR spectra of beef under different heating temperatures

3 結論

基于CPMG序列測定牛肉在不同加熱溫度和時間下的橫向弛豫時間T2,分析了核磁信號峰的參數。結果表明肉樣中存在3種不同水分群,隨著加熱溫度升高,時間延長,LF-NMR多組分弛豫圖譜中代表不易流動水的峰面積減小,而自由水的峰面積隨之增大。在峰形狀上,T22峰高度明顯降低,寬度增大;T23峰出峰后變寬;3個峰峰位置都顯著左移。牛肉受熱過程中NIR光譜變化特征是890、945、1 430、1 750、2 070 nm處,物質對近紅外光吸收減少,反射值增高。

對不同溫度下加熱的牛肉進行了二維相關光譜和移動窗口分析,結果表明氫鍵光譜的變化時序為:945 nm>890 nm>1 430 nm>2 070 nm>1 750 nm,可以推斷出牛肉熟化過程中不同官能團的變化時序為O—H→C—H→N—H→S—H。研究結果還顯示,加熱溫度對牛肉分子結構的影響是非線性的,明顯分為2個階段。溫度達到70 ℃后,核磁共振譜和近紅外光譜都劇烈變化;溫度達到100～110 ℃時,牛肉波譜再次劇烈改變。結合牛肉的物質結構可推知,70～80 ℃時對熱敏感的分子受到影響,如水溶性蛋白質開始失活變性,半結合水發生遷移;但依然有大量基團保持了穩定。蛋白質空間結構直到100～110 ℃的高溫才被進一步破壞,大量氫鍵斷裂以及疏水基團暴露。這揭示了低溫/高溫肉制品分別選擇70 ℃和110 ℃附近進行熱處理的合理性。本文通過核磁共振和近紅外光譜相結合的波譜技術,分析了肉品受熱時的水分遷移及分子振動變化規律,為低溫/高溫肉品熱加工技術提供科學參考。