雙靶標實時熒光PCR檢測技術用于牛結核病快速診斷的研究

歐喜超 趙冰 滕沖 張思琦 許曄 邢睿達 裴少君 夏輝 王勝芬 范偉興 趙雁林

【Fundprogram】 National Key Research and Development Program (2022YFC2305204); Key Research and Development Plan of Tibet Autonomous Region (XZ202201ZY0007N-01)

結核病是由結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)感染引起的人畜共患疾病。牛分枝桿菌是MTBC中宿主范圍最為廣泛的菌種,可感染人和牛等50多種哺乳動物和20多種禽類[1]。在家畜中,牛對MTBC菌株最易感,牛結核病在我國被列為二類動物疫病,是一種慢性消耗性傳染病。目前,我國對動物結核病主要采取“監測、檢疫、撲殺、消毒”的綜合防控措施,但仍缺乏快速診斷的有效方法。因此,準確診斷牛結核病,對于有效降低檢疫凈化成本、控制人畜共患結核病,進而徹底消除結核病對人類的危害具有十分重要的意義[2-4]。

結核病病原學診斷技術主要包括抗酸桿菌染色涂片鏡檢、分枝桿菌培養和分子生物學檢測。動物樣本涂片鏡檢陽性率較低,培養試驗耗時長,不適用于牛結核病的早期發現。分子生物學檢測技術具有較成熟的檢測靶標,操作簡單快捷,被認為是最有潛力的一類結核病診斷技術。Xpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)和Xpert MTB/RIF Ultra(簡稱“Xpert Ultra”)檢測試劑盒是在美國Cepheid公司GeneXpert檢測系統的基礎上,研發出來的MTB全封閉自動化檢測試劑盒,該試劑盒可實現對MTB和利福平耐藥的快速檢測[5],已被廣泛應用于結核病檢測項目,對全球結核病控制做出了很大的貢獻[6]。然而,昂貴的試劑設備和維護成本阻礙了這一檢測系統在動物結核病早期診斷領域的推廣應用。

本研究通過針對MTBCIS6110和IS1081基因,開發雙靶標實時熒光PCR檢測技術,結合自動化核酸提取檢測設備,探索雙靶標熒光PCR檢測特異度和動物組織樣本檢出限,通過對有明顯結核病變的奶牛組織病料進行液體培養、Xpert、Xpert Ultra 和雙靶標實時熒光PCR檢測,評價雙靶標熒光PCR檢測在剖檢奶牛病料中檢測MTBC的效能。

材料和方法

一、材料和試劑

1．樣本來源:用接種環刮取2～3周新鮮牛分枝桿菌(ATCC 19210)菌落,使用細菌超聲分散計數儀制備1麥氏濁度菌懸液,進行10倍系列稀釋后接種到無菌培養皿,完成培養和菌落計數,獲得起始菌液的菌落數(colony forming unit,CFU)。將1麥氏濁度菌懸液通過梯度稀釋制備6種不同濃度的菌懸液(2500 CFU/ml,1250 CFU/ml,625 CFU/ml,313 CFU/ml,156 CFU/ml,78 CFU/ml)。使用組織研磨儀將健康牛肺組織制成乳劑后混入牛分枝桿菌菌懸液,制備6種不同菌液濃度的牛肺病料,用于雙靶標熒光PCR體系的最低檢測限分析。

于2022年5月,在河北省選取2家牛場,對存欄的奶牛進行牛結核病篩查,對篩查出的結核菌素皮膚試驗(PPD試驗)和γ-干擾素釋放試驗(IGRA)陽性奶牛進行無害化處理,在無害化處理場無菌采集有明顯結核病變的35頭奶牛組織病料并送至中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室。現場共采集50份結核病變明顯的病料,病變部位可見明顯結節、膿液或壞死,實驗室人員收到病料后立即開展相關實驗室檢測。

2.主要設備和試劑:Lab-Aid 824s(180014)核酸提取儀,SLAN-96S全自動醫用PCR分析系統,GeneXpert檢測設備,MGIT 960液體培養系統,組織研磨儀。Xpert和Xpert Ultra試劑盒均購自美國Cepheid公司,BACTEC MGIT 960液體培養管購自美國BD公司。核酸酶、蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、dNTP和10×PCR緩沖液由廈門致善生物科技股份有限公司提供。

3.引物和探針:從NCBI GenBank數據庫下載基因IS6110(GenBank檢索號:X17348.1)和IS1081(GenBank檢索號:888515)核苷酸序列,使用軟件Primer Premier 5.0和OligoAnalyzer Tool (https://sg.idtdna.com/pages/tools/oligoanalyzer)設計引物和探針(表1)。通過Blast分析確認PCR引物對MTBC菌株的特異性。所有引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 不同分子生物學技術檢測奶牛組織病料對結核分枝桿菌復合群的檢測效能分析

二、研究方法

1. 病料前處理:肺部淋巴結組織在生物安全柜內用無菌手術剪和手術鑷剝去脂肪和組織被膜,挑取0.5 g病變組織放入帶有5 mm和3 mm研磨珠的2 ml無菌研磨管,加入0.3 ml生理鹽水,然后將研磨管放入組織研磨儀進行研磨(60 Hz,90 s),將研磨后病料分裝至3管50 ml離心管中,分別進行液體培養、Xpert、Xpert Ultra和雙靶標熒光PCR檢測。

2. MGIT 960液體培養:將50 ml 6% NaOH溶液、50 ml 2.9%檸檬酸鈉和0.5 g N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)混合,配置100 ml NALC-NaOH消化液,在生物安全柜內向裝有研磨后病料的50 ml離心管內加入2倍體積NALC-NaOH消化液,作用15 min后,在生物安全柜內打開離心管蓋,加入0.067 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液至45 ml,以 3000×g離心15 min后,棄去上清液,加入1 ml磷酸鹽緩沖液混勻后進行MGIT 960液體培養。陽性培養物進行MPT64抗原初步菌種鑒定[7]和全基因組測序菌種鑒定[8]。

3.熒光PCR檢測:擴增體系包含:1×PCR緩沖液,400 nmol/L上游引物和下游引物,200 nmol/L探針,3 mmol/L鎂離子,0.24 mmol/L dNTP,2 UTaqDNA聚合酶。體系擴增程序:退火95 ℃,退火溫度68 ℃(每循環降低1 ℃),延伸72 ℃,共10個循環;退火95 ℃,退火溫度58 ℃,延伸71 ℃,共45個循環。

取500 μl研磨后的病料,放置在5 ml凍存管中,加入1000 μl研磨消化液,再加入10 μl核酸酶和20 μl蛋白酶K,上下顛倒混勻數次,37 ℃溫浴10 min,99 ℃加熱10 min,取全部上清液進行核酸提取。使用Lab-Aid 824 MTB核酸提取Maxi試劑盒提取上述病料樣本,每種樣本提取1份,提取結束后將核酸取出,放于EP管內備用。取25 μl提取后的核酸作為模板加入反應管。

4.特異性驗證:為保證體系對MTBC檢測的特異性,選擇了21種常見非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)進行體系特異性驗證,包括:猿猴分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、施氏分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、M.agrarius、潰瘍分枝桿菌、胃分枝桿菌、不產色分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、淺黃分枝桿菌。加入與模板體積相等的雙蒸水作為無模板對照。

5.GeneXpert檢測:將Xpert和Xpert Ultra試劑盒配套的處理液加入到含有前處理后病料的離心管中,渦旋振蕩后靜置15 min,將處理后樣品由加樣孔緩慢加入到反應盒內,然后上機并讀取檢測結果[9-10]。

三、統計學處理

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計學分析,計數資料以“百分率(%)”描述,組間差異的比較采用配對χ2檢驗(McNemar test),以P<0.05為差異有統計學意義。使用Probit概率模型計算肺組織病料雙靶標實時熒光PCR檢測的檢出限;采用四格表的形式計算檢測技術的敏感度和特異度,評價不同分子生物學檢測技術對牛分枝桿菌的檢測效能。

結 果

一、雙靶標實時熒光PCR檢測特異性和檢出限

使用1株MTB(H37Rv)、1株牛分枝桿菌和21株 NTM菌株的DNA作為雙靶標實時熒光PCR檢測的檢測模板。只有MTB和牛分枝桿菌菌株的DNA顯示陽性結果,檢測NTM DNA或空白對照時,均未觀察到擴增曲線。雙靶標實時熒光PCR檢測MTBC的特異度為100.0%(21/21)。

雙靶標實時熒光PCR檢測在人工肺組織樣本牛分枝桿菌(ATCC 19210)菌液濃度為600 CFU/ml以上時,檢測命中率均為100.0%(20/20),對菌液濃度為300、250、200、150、100、50和10 CFU/ml組織樣本的陽性檢出率分別下降到95.0%(19/20)、90.0%(18/20)、85.0%(17/20)、85.0%(17/20)、45.0%(11/20)、0(0/20)、0(0/20)。通過使用概率模型計算,雙靶標實時熒光PCR檢測組織樣本牛分枝桿菌的檢出限為244.4 CFU/ml(95%CI:91.9～158.2 CFU/ml)。

二、剖檢奶牛病料基本情況

通過剖檢PPD試驗和IGRA檢測陽性奶牛,在35頭奶牛中發現有明顯的結核病變,共無菌采集50份病料,其中,腸系膜淋巴結病料3份(6.0%),肺淋巴結病料15份(30.0%),肺門淋巴結病料13份(26.0%),肝門病料6份(12.0%),乳房病料3份(6.0%),脾臟病料1份(2.0%),不詳9份(18.0%)。送檢全部病料均存在不同程度的結核病變,切開結核病變可見大量的干酪樣物質。

三、不同方法檢測陽性率比較

在50份送檢病料中,液體培養、Xpert、Xpert Ultra和雙靶標熒光PCR檢測陽性率分別為64.0%(32/50)、56.0%(28/50)、78.0%(39/50)和76.0%(38/50)。雙靶標熒光PCR檢測陽性率明顯高于Xpert檢測陽性率,差異有統計學意義(χ2=4.456,P=0.035);雙靶標熒光PCR檢測陽性率與Xpert Ultra檢測陽性率差異無統計學意義(χ2=0.056,P=0.812)。32株分離培養陽性菌株,經全基因組測序比對發現全部為牛分枝桿菌。

四、不同方法檢測效能評價

排除1份Xpert檢測失敗、1份Xpert Ultra檢測失敗和2份培養污染病料,共46份病料可用于診斷效能評價。以液體培養結果為參照標準,Xpert、Xpert Ultra和雙靶標熒光PCR檢測MTBC的敏感度分別為77.4%(24/31)、96.8%(30/31)和90.3%(28/31)。雙靶標熒光PCR檢測敏感度明顯高于Xpert檢測,差異有統計學意義(χ2=5.165,P=0.017),與Xpert Ultra檢測敏感度差異無統計學意義(χ2=1.069,P=0.301),見表1。

討 論

動物結核病控制的首要任務是快速準確地找出傳染源,及時切斷傳播途徑。目前常用牛結核病篩查方法為PPD試驗。PPD試驗是世界動物衛生組織推薦的診斷牛結核病的主要方法,該方法在牛結核病的診斷與防控過程中發揮了重要作用。但PPD試驗結果的準確性會受到牛只個體差異、人為判定誤差、環境分枝桿菌干擾(如禽分枝桿菌),以及PPD試劑質量的影響,診斷準確性較差[11]。與PPD試驗相比,IGRA不受大多數非致病分枝桿菌的影響,具有更高的敏感度和特異度,但仍然會受到少部分非致病性分枝桿菌(如禽分枝桿菌)干擾,造成一定的假陽性,導致檢測陽性牛剖檢后無法找到結核病變,無法對剖檢牛進行最終確診[12]。本研究發現,通過對PPD試驗和IGRA檢測陽性奶牛進行剖檢后,取病變組織開展MTBC分子檢測,可及早確診牛結核病,提高牛結核病檢測的特異度,進而可以通過對牛場及早開展干預措施,避免牛結核病在人群和動物中的進一步傳播。本研究通過將奶牛病料消化處理后采用MGIT 960液體培養方法進行分枝桿菌分離培養,分枝桿菌的分離培養陽性率較高,分離培養陽性菌株有助于下一步通過全基因組測序或基因分型研究,掌握我國感染牛分枝桿菌的遺傳進化和流行特征。本研究發現,剖檢動物樣本MTBC 分子檢測陽性率高于液體培養試驗,且檢測快速。因此,推廣新型MTBC分子檢測技術,對于提高動物結核病診斷的準確性和及時性,深入研究動物結核病流行傳播等至關重要[13]。

常用MTBC分子檢測靶標基因包括IS6110、IS1081、16SrRNA、gyrB和rpoB基因等,以IS6110和IS1081等多拷貝基因為靶標的檢測技術其敏感度明顯高于單拷貝基因檢測技術。但IS6110并非存在于所有MTBC菌株中,極少部分MTBC菌株中拷貝數較低甚至缺失,可能導致假陰性結果。由于卡介苗菌株僅含有1個IS6100拷貝,但含有5個IS1081拷貝,牛分枝桿菌IS1081拷貝數通常高于IS6110拷貝數[14],因此,對多個靶標基因進行聯合檢測,對牛結核病早期診斷具有十分重要的意義。目前臨床運用非常廣泛的Xpert檢測是一種以半巢式實時定量PCR為基礎的全自動一體化檢測技術,可同時檢測MTB和利福平耐藥性,操作簡便,結果報告時間短,第2代Xpert Ultra以IS6110和IS1081為檢測靶標,其檢測敏感度明顯提高,特異度略有降低[10]。但由于Xpert檢測需要專用的檢測設備,檢測通量低且試劑成本較高,限制了其在動物結核病早期診斷領域的推廣應用。熒光PCR檢測試劑盒屬于開放性的檢測產品,可在通用的實時熒光PCR儀上使用,不需要額外的檢測設備,每批最多可以檢測94個樣本,適合開展大范圍檢測。本研究發現,雙靶標實時熒光PCR檢測組織樣本牛分枝桿菌的檢出限為244.4 CFU/ml,而文獻報到Xpert檢測含卡介苗人工痰的檢出限為344.1 CFU/ml,Xpert Ultra檢測含卡介苗人工痰的檢出限為143.4 CFU/ml[14],這可能與組織樣本核酸提取過程復雜,造成核酸損耗較多有關。本研究通過對病料樣本同時進行上述3種分子檢測,發現雙靶標熒光PCR檢測MTBC陽性率明顯高于Xpert檢測,與Xpert Ultra檢測陽性率無明顯差異;以液體培養結果為參照標準,發現雙靶標熒光PCR檢測MTBC的敏感度也明顯高于Xpert檢測,與Xpert Ultra檢測敏感度無明顯差異。但雙靶標熒光PCR檢測成本明顯降低,檢測通量大,適合在動物結核病早期診斷領域進行推廣使用。

本研究局限性在于未能采集活畜體液標本進行檢測,下一步將進一步評價雙靶標熒光PCR檢測技術在動物體液樣本中檢測MTBC的可行性。本研究發現,組織病料結核病變奶牛已處于結核病后期感染階段,2家牛場已發生牛結核病的聚集性感染,建議下一步采集奶牛痰液、乳汁、尿液和糞便樣本進行分子生物學檢測,早期發現并有效控制傳染源,避免牛結核病的進一步流行傳播。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻歐喜超:實施研究、采集數據、分析/解釋數據、起草文章、統計分析;趙冰:醞釀和設計實驗、實施研究、采集數據;滕沖:采集數據、分析/解釋數據、統計分析;張思琦:采集數據、分析/解釋數據、起草文章;許曄:醞釀和設計實驗、起草文章;邢睿達:實施研究、采集數據;裴少君:分析/解釋數據、統計分析、指導;夏輝:分析/解釋數據、對文章的知識性內容作批評性審閱、指導;王勝芬:醞釀和設計實驗、分析/解釋數據、對文章的知識性內容作批評性審閱、統計分析、指導;范偉興:醞釀和設計實驗、對文章的知識性內容作批評性審閱、指導;趙雁林:醞釀和設計實驗、對文章的知識性內容作批評性審閱、獲取研究經費、指導