人胚胎滋養細胞獨立合成并分泌孕酮時間的探討

李潔 莫似恩 王書佳 莫馥華 乃東紅

孕激素主要由卵巢黃體和妊娠滋養葉細胞合成。生理狀態下,排卵后卵泡液流出,卵泡壁的卵泡顆粒細胞和卵泡內膜細胞塌陷并共同形成黃體,在黃體生成素(LH)峰的作用下,兩種細胞進一步黃素化并分泌孕激素[1]。孕激素促進子宮內膜充分轉化,為胚胎著床提供條件,同時抑制子宮收縮,維持妊娠[1-3]。有研究表明,在沒有妊娠黃體支持的情況下,妊娠可能是不穩定的,直到胎盤形成并開始分泌孕酮[1-2]。

1972年,Csapo等[2]研究證實在胎盤形成前切除黃體會導致流產。體外受精-胚胎移植(IVF-ET)過程中因促排卵用藥及手術操作等影響,存在著明顯的黃體功能不足[3-5]。因此,對IVF助孕后的患者進行充分的黃體支持顯得非常重要[6-7]。多數學者認為妊娠8～10周后,胎盤合體滋養細胞是產生孕激素的主要來源,并在此基礎上建議IVF助孕后黃體支持需進行至妊娠10～12周[8-10]。然而,由于卵巢黃體及胚胎滋養細胞交叉分泌孕激素的影響,目前關于胚胎滋養細胞開始獨立合成并分泌孕激素的相關研究甚少。

地屈孕酮作為IVF助孕中黃體支持的藥物之一,是一種強有力的口服孕激素受體激動劑[11-13]。地屈孕酮由天然孕激素逆轉結構后形成。這種逆轉結構的變化使得地屈孕酮與孕激素受體的結合力超過天然孕酮,且不與雌激素、雄激素受體結合,即口服后不產生雌激素、雄激素活性[14-18]。令人感興趣的是,在臨床應用中,由于地屈孕酮口服后按常規的孕激素試劑并不能檢測出其在血中的濃度[5],利用這一特性,本研究探討在凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)周期中胚胎滋養細胞獨立分泌的孕激素在人血液中的動態變化,并為胚胎移植后進行黃體支持的時間及劑量提供可靠的依據。

對象與方法

一、研究對象

選取2019年3月1日至9月15日在本中心行凍融胚胎移植的患者進行前瞻性隊列研究,患者年齡20～40歲,月經周期規律,隨機納入符合以上條件且用自然周期(natural cycle,NC)、人工周期(hormone replacement cycle,HRT)進行內膜準備的患者。排除孕前或孕期接受過放射性治療、既往自然流產史、有皰疹病毒、巨細胞病毒、風疹病毒、弓形蟲病毒感染的患者;甲狀腺功能異常、高泌乳素血癥患者也需排除。除地屈孕酮外,額外使用其他孕激素劑型進行黃體支持的患者也需要排除。對納入患者的一般資料進行描述,包括平均年齡、體重指數(BMI)、不孕原因及移植胚胎情況。所有的研究對象均知情同意。

二、方法

1.內膜的準備及分組:依據內膜準備的方案不同,分為NC組和HRT組。NC組于月經周期第11天開始,定期用陰道B超監測子宮內膜增長情況以及卵泡大小,并結合血清黃體生成素( luteinizing hormone,LH) 、雌二醇(estradiol,E2 ) 和孕激素(progestin,Prog) 水平來確定排卵,排卵后立即給予地屈孕酮( 荷蘭蘇威制藥公司,10 毫克 /片) 20 mg每日三次口服進行黃體支持,內膜轉化5 d后在 B 超引導下進行囊胚移植。HRT組于月經來潮或孕激素撤藥性出血第3天 起每日口服戊酸雌二醇片(補佳樂,拜耳中國有限公司,1毫克 /片) 3 mg,用藥7 d后用陰道超聲監測子宮內膜生長情況,若子宮內膜厚度≥7 mm,則繼續按原劑量口服補佳樂5 d;若子宮內膜厚度<7 mm,則加量至口服補佳樂6毫克/天,總計口服補佳樂12～15 d,當子宮內膜厚度≥8 mm 時加用地屈孕酮20 mg每日三次口服進行內膜轉化,5 d后進行囊胚移植,移植后繼續按原劑量雌孕激素替代治療。若妊娠,則繼續原量黃體支持至孕8～10周后逐漸減量(圖1)。

圖1 解凍周期血清采樣和超聲檢查時間Figure 1 The time of serum sampling and sonography for frozen-thaw embryo transfer cycle regimen

2.干預及檢驗指標:所有研究對象在移植后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d分別抽取靜脈血3～5 mL,以3 000 r/min離心5 min后取上層血清,置于2～8℃冰箱待檢,用羅氏電化學發光免疫分析法(Elecsys ECLIA)檢測血清孕激素及β-hCG水平,儀器與試劑為美國貝克曼公司生產的ACCESS2全自動免疫發光分析儀及其配套試劑。對于移植后14 d血β-hCG≥25 IU/L定義為生化妊娠,并于移植后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d繼續動態監測血清孕酮及β-hCG水平,并進行地屈孕酮黃體支持(圖1)。對移植后未妊娠的患者,則終止血清孕酮及β-hCG水平的監測。

3.統計學處理:采用SPSS19.0進行數據處理及統計分析,計量資料以均數±標準差表示,組間比較采用t檢驗及方差分析;當數據不滿足方差齊性檢驗時,采用Welch′s Anova和Kruskal-Wallis檢驗。對計數資料采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、一般資料及妊娠隨訪情況

初步納入患者共400例,其中HRT組218人,NC組182人,兩組胚胎移植后14 d血hCG陽性的患者共258例(HRT組144人,NC組114人)。患者的年齡、不孕年限、基礎泌乳素水平、原發/繼發不孕癥、體重指數(BMI)及平均移植胚胎數組間一般資料比較差異均無統計學意義,見表1。

表1 納入的妊娠患者基本信息比較Table 1 Comparison of basic information of included pregnant patients

兩組共有258例患者血清hCG陽性。其中HRT組的臨床妊娠率為62.4%(136/218),其中26名患者因有先兆流產癥狀,予黃體酮注射液進行保胎治療,2名患者因恐慌孕激素過低,但并無先兆流產癥狀,在當地醫院自行使用黃體酮注射液治療,6名患者拒絕每周孕激素監測。NC組中臨床妊娠率為60.4%(110/182),8名患者隨訪中有先兆流產癥狀,予黃體酮注射液保胎治療,2名患者因就診路途遙遠及個人因素拒絕每周的孕激素監測。最終對202名妊娠患者(HRT組102例,NC組100例)進行每周孕激素的監測,監測結果見表1、表2和圖2。與NC組相比,HRT組的先兆流產發生率較高(19.1% vs.7.3%),差異有統計學意義。

表2 兩組血清孕酮和 β-hCG水平比較Table 2 Comparison of serum progesterone and β-hCG levels between two groups

圖2 解凍周期胚胎移植后妊娠結局隨訪情況Figure 2 Follow-up of pregnancy outcomes after the frozen-thaw embryo transfer cycle

二、兩組血清孕激素和hCG水平的監測及比較

NC組在移植后7 d、14 d、21 d、28 d和35 d檢測的血清孕激素平均水平為22.84 ng/mL,25.98 ng/mL,26.45ng/mL,28.04 ng/mL和28.75 ng/mL,無明顯變化趨勢(見圖3)。HRT組在移植后7 d、14 d、21 d、28 d和35 d中的血孕激素檢測的平均水平為0.77 ng/mL, 0.90 ng/mL, 2.22 ng/mL, 5.49 ng/mL和10.05 ng/mL,呈緩慢增長的趨勢(見圖4)(P<0.05)。HRT組中,孕激素從胚胎移植后14 d開始逐漸分泌,移植后21 d孕酮平均水平達到2.22 ng/mL。移植后28 d,有一定數量的孕激素分泌,孕激素平均水平達到5.49 ng/mL。移植后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d,兩組血中hCG水平均顯著升高(P<0.05)。NC組移植后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d孕激素水平明顯高于HRT組(P<0.05)。兩組hCG水平差異無統計學意義。

Annotation:The horizontal coordinate is the number of days(days) after FET, and the vertical coordinate is the concentration of progesterone level(ng/mL)圖3 自然周期組孕酮水平監測情況Figure 3 Monitoring progesterone concentration in group NC

Annotation:The horizontal coordinate is the number of days(days) after FET, and the vertical coordinate is the concentration of progesterone level(ng/mL) 圖4 人工周期組孕酮水平監測情況Figure 4 Monitoring progesterone in group HRT

討 論

孕激素是雌激素的前體,妊娠8周前由滋養葉細胞及卵巢黃體分泌產生,妊娠8～10周后,胎盤合體滋養細胞是產生孕激素的主要來源[8,19]。在自然妊娠8周前,由于妊娠黃體產生孕激素的干預,目前關于胚胎滋養葉細胞獨立開始分泌孕激素的時間及其動態變化的研究甚少。本研究通過凍融胚胎移植的人工周期的去黃體功能,使用地屈孕酮口服進行黃體支持。地屈孕酮由于其逆轉結構,不能用常規孕酮測定試劑在血液中檢測,結合地屈孕酮的逆轉結構變化,用常規孕酮測定試劑來監測胚胎滋養葉細胞獨立開始分泌孕激素的時間,為黃體支持持續的時間提供依據[5]。

在本次研究過程中,一共收集了NC和HRT兩組妊娠數據,分別對其血清hCG及孕激素進行動態監測,并進行對比分析。本研究結果顯示,在HRT組中,胚胎滋養細胞在移植后14～21 d開始有少量的孕激素分泌,移植后28 d分泌較多量的孕激素。目前,多數學者認為妊娠8～10周后,胎盤合體滋養細胞是產生孕激素的主要來源,并在此基礎上建議IVF助孕后的患者調整外源性黃體支持用藥劑量的時間是孕8～10周[8-10]。然而,這些學者雖然考慮到胎盤合體滋養細胞是產生孕激素的主要來源,卻忽略了胚胎滋養細胞本身在妊娠早期也能同樣分泌較多的孕激素。因此,依據本次研究的結果,建議在胚胎移植后28 d(即孕6周),可考慮調整外源性黃體支持的用量,甚至開始逐漸減量,以減輕患者經濟負擔以及大劑量黃體支持藥物帶來的相關副作用。本研究NC組中由于妊娠黃體的孕激素分泌,其孕激素的濃度一直處于較高的水平,并明顯高于HRT組,但兩組之間的血hCG水平并無差異。而血hCG作為人體妊娠的特異性激素,主要是增加孕激素及雌激素的分泌,從而促進子宮蛻膜形成,進而加快胎盤生長成熟,是促進胚胎生長發育的重要指標之一[20]。地屈孕酮作為黃體支持的藥物之一,雖然常規的孕激素試劑并不能檢測出其在血中的濃度,但患者在服用地屈孕酮后,藥物仍具有較高的生物活性[8,21]。據估計,地屈孕酮的半衰期為5～7 h,而20a-羥基地屈孕酮的半衰期為14～17 h[21]。其作用前的受體調節主要是通過氧化還原酶1C1將地屈孕酮轉化為具有生物活性的20a-羥基代謝物,繼續發揮孕激素的效應[21]。地屈孕酮是天然孕激素經紫外線照射后產生的逆轉異構體,與內源性孕激素具有相似的分子結構,僅在碳原子C6和C7之間多了一個雙鍵,9、10位碳原子上的氫原子和甲基與天然孕激素反向[22-24]。這種“逆轉”結構使得地屈孕酮對孕激素受體具有高度的親和力,且結合力超過天然孕酮,沒有雌激素和雄激素的特性,生物利用度高[17-18, 25]。在動物實驗中,口服地屈孕酮與注射黃體酮作用相當[26]。此外,地屈孕酮的孕酮受體及其保留逆轉錄結構的代謝物的選擇性較高[27]。

在本次研究的兩組患者中,有部分患者出現先兆流產的癥狀,且HRT組較NC組先兆流產的發生率較高(19.1% vs.7.3%,P<0.05)。在地屈孕酮臨床應用中,患者在檢測血清孕激素濃度時無法看到地屈孕酮的效應,僅看到自身偏低的孕激素水平,可能會引起患者的過度恐慌,誘發先兆流產的癥狀,但也不排除地屈孕激素本身在HRT組進行黃體支持時藥效相對缺乏[28-30]。有先兆流產癥狀的患者,均予黃體酮注射液進行保胎治療,且結局良好。但隨訪中由于使用黃體酮注射液的干預,終止了血清孕酮及β-hCG水平的監測。由于隨訪過程中部分患者先兆流產癥狀的出現,需進行藥物干預,以及部分妊娠患者拒絕監測孕激素的動態變化,導致較多的患者未能進入隊列隨訪。盡管最終納入此次隊列研究的樣本量較少,但仍能觀測到胚胎滋養細胞開始分泌孕激素的時間及其動態變化的趨勢。除此之外,此次研究還有一些不足的地方。本研究需妊娠患者每周復診進行孕激素的檢測,由于考慮到患者復診的次數較多且多為外地就診患者,就診不便,此次研究僅檢測到移植后35 d(即孕7周),并沒有監測到孕激素達到穩定狀態的時間。后續本中心將進行更全面、更長時間監測以及更大樣本量的統計分析,來指導IVF助孕后進行黃體支持的有效時間。

本研究結果表明,胚胎滋養細胞分泌的孕激素在胚胎移植后14～21 d血液中可被檢測到,在移植后28 d分泌的孕激素量明顯增多。因此,建議胚胎移植后28 d(即孕6周),可考慮外源性黃體支持的調整用量,甚至開始逐漸減量,以減輕患者經濟負擔和可能產生的副作用。但地屈孕酮在HRT中黃體支持的藥效及劑量仍需要后續更大樣本量的研究。