Klotho蛋白對腎缺血再灌注大鼠急性腎損傷及纖維化的保護作用

劉竹楓　王文紅　范樹穎　劉艷　劉濤　王欣　吳瑕

摘要：目的 探討Klotho蛋白在缺血再灌注（I/R）大鼠引起的急性腎損傷及纖維化進程中的作用。方法 60只健康雄性SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組（Sham組）、腎臟缺血再灌注組（I/R組）和Klotho蛋白干預組（I/R+Kl組），每組20只。I/R組采用夾閉右側腎蒂40 min再灌注法建立腎缺血再灌注急性腎損傷模型。Sham組游離出右側腎動脈，但不夾閉右側腎蒂，暴露40 min后縫合腹腔。I/R+Kl組手術方法同I/R組，造模成功后，腹腔注射Klotho蛋白（0.01 mg/kg）。3組分別于造模成功后第1、7、14、28天收集大鼠血、腎組織標本，分別檢測大鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平；HE染色觀察腎組織損傷情況，Masson染色觀察腎纖維化情況，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清及腎組織Klotho蛋白水平，Western blot法檢測腎臟組織Klotho蛋白的表達。結果 與Sham組比較，I/R組及I/R+Kl組血Scr及BUN水平均升高（P＜0.05），與I/R+Kl組比較，I/R組各時間點血Scr及BUN水平均升高（P＜0.05）。HE染色結果顯示，第1天時I/R組腎小管出現廣泛急性壞死，I/R+Kl組損傷較輕微。Masson染色結果顯示，I/R組第14天出現了輕度的纖維化，第28天時纖維化程度更為顯著，I/R+Kl組纖維化程度較輕微（P＜0.05）。ELISA結果顯示，第1、14、28天時與Sham組比較，I/R+Kl組及I/R組血清及腎組織Klotho水平下降（P＜0.05），I/R組血清及腎組織Klotho水平均低于I/R+Kl組（P＜0.05）。Western blot結果顯示，與Sham組比較，各時間點I/R組及I/R+Kl組Klotho水平均下降，而I/R+Kl組Klotho水平均高于I/R組（P＜0.05）。結論 腎缺血再灌注腎損傷時Klotho表達下調；外源性補充Klotho蛋白可緩解缺血再灌注腎損傷大鼠的急性腎損傷及纖維化，起到腎保護作用。

關鍵詞：急性腎損傷；再灌注損傷；纖維化；腎疾?。籏lotho蛋白

中圖分類號：R726.92文獻標志碼：ADOI：10.11958/20221063

Protective effect of Klotho protein on acute renal injury and fibrosis in

rats with ischemia-reperfusion

LIU Zhufeng， WANG Wenhong FAN Shuying， LIU Yan， LIU Tao， WANG Xin， WU Xia

Department of Nephrology， Tianjin Childrens Hospital， Tianjin University Children′s Hospital， Tianjin 300134， China

Corresponding Author E-mail： docwwh@163.com

Abstract： Objective To investigate the role of Klotho protein in acute renal injury and fibrosis induced by ischemia-reperfusion （I/R） in rats. Methods Sixty healthy SD rats were randomly divided into the sham operation group （sham group）， the renal ischemia-reperfusion group （I/R group） and the Klotho protein intervention group （I/R+Kl group）， with 20 rats in each group. In the I/R group， the acute renal injury model of I/R was established by clamping the right renal pedicle for 40 min. In the sham group， the right renal artery was dissociated， but the right renal pedicle was not clamped. After exposure for 40 minutes， the abdominal cavity was sutured. The operation method of the I/R+Kl group was the same as that of the I/R group. Kiotho protein （0.01 mg/kg） was injected intraperitoneally. The blood and renal tissue samples were collected on the 1st， 7th， 14th and 28th days after successful modeling in the three groups， and blood creatinine （Scr） and blood urea nitrogen （BUN） were measured respectively. HE staining was used to observe the damage of renal tissue. Masson staining was used to observe the renal fibrosis. ELISA was used to detect levels of Klotho protein in blood and renal tissue. Western blot assay was used to detect the expression of Klotho protein in renal tissue. Results Compared with the sham group， levels of SCR and BUN were increased in the I/R group and the I/R+Kl group （P＜0.05）. Compared with the I/R+Kl group， serum levels of SCR and BUN were increased in different time points in the I/R group （P＜0.05）. HE staining showed extensive acute necrosis of renal tubules in the I/R group， and the injury was mild in the I/R+Kl group. Masson staining showed that mild fibrosis occurred in the I/R group on the 14th day， and the degree of fibrosis was more significant on the 28th day， while the degree of fibrosis was very mild in the I/R+Kl group （P < 0.05）. ELISA results showed that compared with the Sham group at day 1， 14 and 28， levels of Klotho in blood and renal tissue decreased significantly in the I/R+Kl group and the I/R group， and the level of Klotho decreased in the I/R group than that of the I/R+Kl group （P＜0.05）. Western blot results showed that compared with the Sham group， Klotho levels were decreased at all time points in the I/R group and the I/R+Kl group. while Klotho levels were higher in the I/R+Kl group than those in the I/R group （P＜0.05）. Conclusion Klotho expression is down-regulated during renal I/R injury. Exogenous supplementation of Klotho protein can alleviate acute renal injury and fibrosis in rats with renal I/R injury and play a role in renal protection.

Key words： acute kidney injury; reperfusion injury; fibrosis; kidney diseases; Klotho protein

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是由多種病因引起的腎功能快速下降而出現的復雜臨床綜合征。AKI后即使腎功能完全恢復，也可能造成慢性腎損害，導致慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）［1］。AKI早期可造成嚴重的腎小管損傷、細胞凋亡和炎性細胞浸潤，進而引起永久性的腎纖維化［2］。而腎纖維化是所有腎臟損傷后導致CKD的共同途徑。解決此問題的關鍵在于早期識別急性腎損傷后腎纖維化進展至慢性腎臟病風險的患者，從而避免AKI向CKD轉化。研究發現，AKI大鼠血清及腎組織Klotho蛋白水平會隨著腎功能的惡化而降低，隨著腎功能的恢復而升高［3］。AKI和CKD患者腎活檢結果均證實Klotho蛋白的表達水平與腎臟損傷程度相關，被認為是AKI及腎纖維化的標志物之一［4］。因此，Klotho蛋白表達水平有可能作為AKI及CKD患者預后評估的一個新型標志物。本研究設計構建了腎缺血再灌注后AKI大鼠模型，探討Klotho蛋白在AKI向腎纖維化進展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60只SPF級8～12周齡健康雄性SD大鼠，體質量（200±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0008。動物房濕度50%～55%，溫度20～25 ℃，動物分籠規范飼料喂養，自由進水。動物實驗方案經天津市兒童醫院醫學倫理委員會和動物管理及使用委員會批準（批件號：KY2020-34）。

1.1.2 主要試劑及儀器 人重組Klotho蛋白（美國PeproTech公司，100-53-20UG）；兔抗Klotho蛋白一抗（Bioss，bs-2925R）；山羊抗兔IgG二抗（ZB-2301），羊抗鼠IgG二抗（ZB-2305）及抗β-actin（北京中杉金橋生物技術有限公司，TA-09）。大鼠Klotho抗體酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，CSB-E14958r）。

1.2 研究方法

1.2.1 動物分組及模型制備 大鼠按隨機數字表法分為假手術組（Sham組）、腎臟缺血再灌注組（I/R組）和Klotho蛋白干預組（I/R+Kl組），每組20只。各組大鼠分別于術后第1、7、14、28天處死5只大鼠進行后續實驗。采用切除一側腎臟，夾閉對側腎蒂法建立腎缺血再灌注后AKI模型：I/R組用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，消毒鋪巾，用剪刀和鑷子沿著大鼠腹部正中做一約1.5 cm縱行切口，打開皮膚和肌肉層，游離出左側腎動脈，用手術線環繞并將其結扎，切除左側腎臟。同樣方式游離出右側腎動脈，用動脈夾將腎蒂夾閉，40 min后松開動脈夾，恢復右側腎臟血液灌流，觀察1 min，肉眼見腎臟由暗紅色逐漸變為鮮紅色，表明再灌注成功，縫合腹腔，觀察大鼠生命體征，同時補充飲水與飼料。Sham組切除左側腎臟，并游離出右側腎動脈，但不夾閉右側腎蒂，暴露40 min后縫合腹腔。I/R+Kl組：手術方法同I/R組，造模成功后，腹腔注射Klotho蛋白（0.01 mg/kg）。3組分別于造模成功后第1、7、14、28天采血并處死大鼠，每組各時間點分別隨機抽取3只大鼠，剝離腎臟，記錄腎臟肉眼外觀，然后用剪刀將腎臟組織剪成小塊（約1 cm3），各取1塊組織置于4%的中性甲醛中4 ℃固定過夜，其余組織于-80 ℃保存備用。

1.2.2 腎功能檢測 腹主動脈采血，4 000 r/min離心10 min，取上清液分別用肌氨酸氧化酶法及紫外-谷氨酸脫氫酶法檢測大鼠血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）。

1.2.3 腎臟組織形態學及纖維化檢查 腎組織經4%中性甲醛固定，乙醇脫水、石蠟包埋、切片（厚度為5 μm）后，HE染色觀察腎組織病理損傷情況，Masson染色觀察腎纖維化情況。由病理醫生根據盲法原則在400倍光鏡下隨機觀察HE染色的組織皮髓交界處10個不重疊視野，以腎小管上皮變性、腎小管管腔擴張、腎小管壞死、炎性細胞浸潤、腎間質水腫和腎間質纖維化的面積作為評價腎小管和腎間質損傷指標，進行半定量分析。評分標準：病變面積＜25%為1分；25%～50%為2分；＞50%～75%為3分；＞75%為4分。計算其平均值，評分越高表明腎小管間質損傷程度越重。

1.2.4 ELISA檢測大鼠血清及腎組織Klotho蛋白水平 收集大鼠血液及新鮮冰凍腎組織勻漿經3 000 r/min，離心10 min后取上清液，采用ELISA法嚴格按試劑盒說明檢測3組大鼠各時間點的血清及腎組織Klotho蛋白水平。

1.2.5 Western blot法檢測腎組織Klotho蛋白表達水平 取新鮮冰凍組織，蛋白勻漿后用Bradford法測定蛋白濃度。取總蛋白50 μg進行上樣電泳，轉到硝酸纖維素濾膜上，經漂洗、封閉后加入稀釋一抗Klotho（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，然后加入相應二抗（1∶5 000）37 ℃孵育1 h，使用凝膠成像儀進行觀察，隨后用Image J軟件測定蛋白灰度值，以目的蛋白與內參β-actin的灰度值比值表示。

1.3 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數據分析。所有數據以均數±標準差（x±s）表示，3組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎功能的變化 與Sham組比較，各時間點I/R組及I/R+Kl組血Scr及BUN水平明顯升高，I/R組各時間點血Scr及BUN水平均高于I/R+Kl組（P＜0.05）。見圖1、2。

2.2 各組大鼠腎臟病理改變 HE染色結果顯示，Sham組各時間段腎小球形態結構無明顯異常、腎小管間質上皮細胞形態清晰，基底膜結構完整。第1天時I/R組可見部分腎小球壞死，腎小管大面積急性壞死，炎性細胞浸潤，滲出，出血改變最顯著。I/R+Kl組腎小球未見明顯異常，腎小管間質可見滲出、出血，程度較I/R組輕，見圖3。第7天兩組的腎小管間質出血滲出較前明顯減輕。Masson染色結果顯示，與Sham組相比，I/R組第14天出現了輕度的纖維化，第28天時纖維化程度加重，I/R+Kl組纖維化程度較I/R組減輕（P＜0.05），見圖4、5。

2.3 各組大鼠血清及腎組織Klotho表達 I/R+Kl組及I/R組第1、14、28天血清及腎組織Klotho水平較Sham組下降，I/R組血清及腎組織Klotho水平較I/R+Kl組下降；第7天，腎Klotho水平3組間差異無統計學意義（P＞0.05），血清Klotho水平I/R組較Sham組降低，I/R+Kl組較I/R組升高（P＜0.05），I/R+Kl組與Sham組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖6、7。

2.4 各組大鼠腎組織Klotho蛋白的表達 與Sham組比較，各時間點I/R組及I/R+Kl組Klotho水平均下降（P＜0.05），而I/R+Kl組Klotho水平均高于I/R組（P＜0.05），見圖8。

3 討論

本研究以I/R大鼠作為AKI動物模型來觀察Klotho蛋白對AKI及AKI后腎纖維化的作用。結果顯示，I/R組各時間點血Scr及BUN水平較Sham組明顯升高，第1天達高峰，提示缺血再灌注以后出現AKI；第7天腎功能水平較前明顯下降；第14、28天血Scr及BUN水平再次升高，HE及Masson染色下第14天腎小管水腫擴張伴輕度間質纖維化；第28天腎小管間質纖維化更為明顯，提示AKI向CKD轉變，證實造模成功。

腎缺血再灌注損傷是臨床上最常見的AKI病因之一。因腎臟有較強的代償功能，輕度短暫的急性腎臟缺血引起的腎功能下降往往可逆，但腎臟長時間缺血缺氧不能及時糾正、修復能力受損可導致進行性腎纖維化及CKD。AKI后進展為CKD的風險顯著上升，腎缺血再灌注損傷后出現腎纖維化是引起CKD的重要原因［5］。AKI進展至CKD是多種細胞參與多種分子信號通路調控的復雜致病過程，目前尚沒有抑制AKI向CKD進展的特異性治療手段。因此，開發能夠延緩或防治AKI后纖維化和保護殘存腎功能的靶向干預治療措施是防治CKD的關鍵［6］。

Klotho蛋白是Klotho基因編碼的一種單向跨膜蛋白，高表達于正常腎小管上皮細胞，具有多種生物學效應，包括細胞保護、抗炎癥反應、抗氧化應激及抗纖維化等。I/R誘導的AKI動物模型研究顯示，Klotho在腎組織、血清及尿液的水平明顯下降，隨著腎功能的恢復，Klotho的表達也逐漸恢復［7］。AKI患者的研究也顯示腎組織中Klotho的表達減少，其減少的程度與血肌酐呈正相關［8］。研究顯示，CKD患者Klotho表達下調，并且腎功能越差，Klotho減少越明顯［9］。因此，AKI時血漿中的Klotho水平有望作為腎實質損傷的生物標志物，在CKD中，Klotho水平也可能是早期疾病的指標，并預測進展速度［10］。

本研究結果表明，I/R誘導的AKI大鼠血清、腎組織Klotho蛋白的水平在AKI第1天明顯下降，之后隨著腎功能的恢復其表達也逐漸恢復，第28天時腎纖維化加重，AKI向CKD轉化，Klotho蛋白水平再次下降，和既往的研究［3］一致。由此可以看出，腎及血清Klotho水平與腎功能有關，AKI時Klotho蛋白的表達為動態且可逆的。Klotho蛋白下降會加劇腎臟損傷，恢復可減輕腎臟損傷，提示Klotho蛋白可能參與了AKI發生發展的病理生理過程。因此，Klotho蛋白有望作為監測腎功能水平的生物學標志物，還可成為潛在的腎臟保護因子。

缺血再灌注向慢性腎臟病進展的主要原因是腎間質纖維化［11］。目前的實驗數據證實Klotho缺陷小鼠存在更嚴重的腎臟損傷和纖維化以及更高的AKI到CKD轉變的風險，這表明Klotho缺乏使腎臟更容易受到急性損傷［9］。在環孢素腎病［12］、阿霉素腎?。?3］、單側輸尿管梗阻［14］等多種纖維化動物模型的研究中證實Klotho基因缺陷或Klotho蛋白表達下調可加重腎纖維化的進展，導致蛋白尿及腎功能水平的下降。章煒等［15］研究表明，外源性Klotho蛋白可能通過抑制細胞凋亡及炎性細胞浸潤等途徑改善腎臟功能、緩解腎臟病理損害、改善纖維化程度，發揮腎臟保護作用。本研究中，補充外源性Klotho蛋白后，該組各時間點的腎功能水平較于I/R組好轉明顯，血及腎組織Klotho蛋白水平表達明顯上調，Masson染色顯示纖維化程度明顯減輕，提示外源性補充Klotho蛋白可減輕AKI后的纖維化程度，減緩CKD進展，證實了Klotho蛋白對腎臟的保護作用。

綜上所述，I/R所致的AKI可導致嚴重的腎小管損傷，遠期可出現腎間質纖維化，使AKI向CKD轉化。AKI時Klotho蛋白表達下調；Klotho蛋白可能參與了AKI發生發展的病理生理過程，Klotho蛋白有望作為監測腎功能水平動態變化的生物學標志物。AKI后外源性補充Klotho蛋白能夠改善AKI后大鼠的腎功能、延緩腎臟病理損傷及腎臟維化的進程，Klotho蛋白有望成為今后預防AKI向CKD進展的新干預靶點之一;而基于Klotho蛋白在AKI向CKD進展的機制進行轉化醫學的相關研究是后期的研究方向。

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（2022-07-05收稿 2022-11-25修回）

（本文編輯 魏杰）