抑癌基因SASH1在乳腺癌中結合Vimentin并負性調節Vimentin的表達

楊娉娉　張景　陳紅宇　張淼　周定安　方文

摘要：目的 尋找參與抑癌基因SASH1調節乳腺癌發生發展的伙伴分子，并分析兩者的相關性以及在乳腺癌發生發展中的作用。方法 利用液相色譜-串聯質譜聯用（LC-MS/MS）技術和免疫共沉淀技術分析與SASH1結合并可能調節乳腺癌發生發展的分子。免疫組織化學和蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測30例正常乳腺組織和123例乳腺癌組織SASH1和波形蛋白（Vimentin）的表達水平，并在乳腺癌中分析兩者之間的相關性。Western blot檢測乳腺癌細胞中敲低SASH1對Vimentin表達的影響。結果 SASH1與Vimentin存在相互作用的可能性為100%。免疫共沉淀證實SASH1與Vimentin可發生蛋白相互作用。免疫組織化學染色結果顯示，與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中SASH1表達降低而Vimentin表達增高，且兩者呈負相關（P＜0.01）。Western blot實驗證實在16例乳腺癌組織和對應的癌旁組織中，乳腺癌組織表現出SASH1低表達，而Vimentin高表達。在乳腺癌細胞中敲低SASH1后Vimentin的表達增高。結論 SASH1可能通過負性調節Vimentin的表達參與乳腺癌的發生發展。

關鍵詞：乳腺腫瘤；波形蛋白；SASH1；蛋白相互作用

中圖分類號：R737.9文獻標志碼：ADOI：10.11958/20222057

Tumor suppressor gene SASH1 binds Vimentin and negatively regulates the expression of Vimentin in breast cancer

YANG Pingping ZHANG Jing CHEN Hongyu ZHANG Miao ZHOU Dingan FANG Wen

1 School of Clinical Laboratory Science， Guizhou Medical University， Clinical Laboratory Center， the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 2 Clinical Medical Research Center， the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University; 3 Department of Endocrinology， the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University

Corresponding Author E-mail： fangwen@gmc.edu.cn

Abstract： Objective To investigate the partner molecules that regulate the tumor suppressor gene SASH1 in the occurrence and development of breast cancer， and to analyze the correlation and role of them in breast cancer development. Methods Liquid chromatography tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） technology， bioinformatics and immunoprecipitation were used to analyze and confirm molecules that may bind with SASH1 and potentially regulate the occurrence and development of breast cancer. Immunohistochemistry and Western blot assay were used to detect the expression levels of SASH1 and Vimentin in normal breast tissue and breast cancer tissue in humans， and to analyze the correlation between the two in breast cancer. The effect of knocking down SASH1 on the expression of Vimentin was also examined in breast cancer cells using Western blot assay. Results LC-MS/MS technology combined with bioinformatics showed that SASH1 was more likely to bind to Vimentin. Immunoprecipitation indicated that SASH1 could bind to Vimentin. In the immunohistochemical staining of 30 cases of normal breast tissue and 123 cases of breast cancer tissue， it was found that compared with normal breast tissue， SASH1 expression was decreased and Vimentin expression was increased in breast cancer tissue. Furthermore， a negative correlation was observed between the immunohistochemical scores of the two proteins （P＜0.01）. Western blot assay indicated that in 16 cases of breast cancer tissue and matched adjacent tissue， the breast cancer tissue showed low expression of SASH1 and high expression of Vimentin. After knocking down SASH1 expression in breast cancer cells， the expression of Vimentin increased. Conclusion The tumor suppressor protein SASH1 may participate in the occurrence and development of breast cancer by negatively regulating the expression of Vimentin.

Key words： breast neoplasms; Vimentin; SASH1; protein-protein interaction

乳腺癌現已超過肺癌成為全球最常見的癌癥，占所有女性癌癥的25%［1］。乳腺癌轉移率高，且發生轉移的機制復雜，缺乏特異的治療靶點和靶向治療方法，因此尋找新的藥物作用靶點對臨床治療有重要意義。SASH1（SAM-and SH3-domain containing 1）為信號調節蛋白SLY家族中的一員。研究表明，SASH1在乳腺癌和其他實體癌中具有抑癌作用［2］。SASH1可抑制多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和上皮間充質轉化（EMT），并與腫瘤分級和預后相關［3］。然而SASH1在乳腺癌發生發展中的具體作用機制仍然未知。波形蛋白（Vimentin）是一種重要的絲狀蛋白，為細胞提供結構和功能支持。不僅與許多腫瘤的發生發展有密切關系，還參與腫瘤細胞的侵襲和轉移［4］。有報道稱Vimentin過表達會促進乳腺上皮細胞的侵襲和遷移［5］，但具體作用機制不明。本研究擬通過檢測乳腺癌與癌旁正常乳腺組織中SASH1與Vimentin的表達水平，分析兩者是否存在相互作用及在乳腺癌發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取2017年5月—2018年8月在重慶市腫瘤醫院收集的123例原發性乳腺癌患者（乳腺癌組）的新鮮腫瘤組織和30例正常乳腺組織（正常組）。基于雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（HER2）的表達，參照《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范（2021版）》，其中Luminal A型47例，Luminal B型34例，HER2陽性22例，三陰性20例。本研究經貴州醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會批準（倫理號：2018倫審第059號）。

1.2 實驗材料 HEK-293T細胞、乳腺癌細胞T47D均購自上海富衡生物科技有限公司；野生型pEGFP-C3質粒購自美國Addgene公司；HA-pcDNA3.0質粒由復旦大學生物醫學研究院饋贈；限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ以及T4 DNA連接酶和PrimeSTAR HS DNA聚合酶（R050Q）購自日本Takara公司；RIPA裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；β-tubulin單克隆抗體購自艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司；山羊抗鼠IgG購自美國Jackson ImmunoResearch Laboratories；兔抗人SASH1多克隆抗體購自美國Novus公司，兔抗人Vimentin多克隆抗體、血凝素（hemagglutinin，HA）和鼠抗人綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）購自美國Proteintech Group公司；2×Taq PCR預混試劑Ⅱ（含染料）和凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；兔二步法試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質粒構建 以廈門大學韓家淮實驗室贈送的Vimentin cDNA為模板，Vimentin基因克隆引物序列：上游5′-CGGGATCCCGGCCACCGCCACCATGGTGAAGTATTTCCTGGGCCA-3′（插入了BamHⅠ酶切位點），下游5′-CGGAATTCCTACACAAACTGTTGCTGCTGCTGC-3′（插入了EcoRⅠ酶切位點）進行擴增。接著用BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內切酶對純化回收后的Vimentin擴增產物和載體HA-pcDNA3.0進行雙酶切。再將純化回收后的酶切產物16 ℃連接20 h，之后取10 μL連接產物進行轉化。挑取轉化后的單克隆菌落于37 ℃培養2 h，使用Taq PCR預混試劑Ⅱ（含染料）進行菌液PCR，并通過瓊脂糖凝膠電泳篩選陽性菌。將篩選出的陽性菌液37 ℃過夜培養（12～16 h），次日使用質粒提取試劑盒提取HA-Vimentin-pcDNA3.0質粒。采用雙酶切法進行初步鑒定，再根據雙酶切初篩鑒定結果將質粒送測序。另外兩組重組質粒SBP-Flag-SASH1-pBABE-puro和GFP-SASH1-pEGFP-C3的構建已于本課題組前期研究［6］中完成。

1.3.2 細胞培養與質粒轉染 以含10%胎牛血清和1 U/mL青霉素的DMEM培養基培養HEK-293T和T47D細胞，并置于37 ℃、5%CO2培養箱中。細胞傳代3次后可用于實驗。待細胞密度約70%后，將質粒按照Lipofectamine 2000試劑說明書制備質粒DNA-脂質體復合物，并將質粒DNA-脂質體復合物加入細胞中培養6 h，更換新鮮培養基繼續培養48 h。收集細胞進行Western blot實驗。

1.3.3 液相色譜-串聯質譜聯用（LC-MS/MS）分析 將課題組前期構建的穩定表達SBS-Flag-SASH1-pBABE-pure的HEK-293T細胞送至復旦大學生物醫學研究院進行LC-MS/MS實驗［6］。穩定表達SBS-Flag-SASH1-pBABE-pure 293T細胞的構建、質譜條件參照課題組前期方法。利用蛋白質專業數據庫（https：//www.uniprot.org/）和KEGG pathway信號通路研究數據庫（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）分析可能與SASH1結合并參與調節乳腺癌發生發展的伙伴分子。

1.3.4 免疫共沉淀技術分析蛋白的相互作用 將轉染SASH1和Vimentin質粒后的HEK-293T細胞收集并離心后，棄上清液。加入細胞裂解液600 μL，冰上裂解1 h，超聲破碎1 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液作為Input蛋白，剩余的上清液加入20 μL A/G瓊脂糖珠進行預清洗。之后4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取出上清液并分別加入4 μg鼠源GFP一抗或兔源HA一抗，在4 ℃旋轉儀上旋轉2 h。最后加入A/G瓊脂糖珠45 μL旋轉過夜。次日4 ℃、3 000 r/min離心10 min后棄上清液，將免疫沉淀物用預冷的PBS洗滌2～3次后加入上樣緩沖液變性，最后進行Western blot實驗。

1.3.5 Western blot檢測蛋白表達水平 取約50 mg乳腺癌及癌旁組織加入裂解液，冰上充分研磨裂解，低溫離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度。每孔以25 μg蛋白進行上樣。經電泳、轉膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入兔源一抗Vimentin（1︰400）、SASH1（1︰400）、鼠源一抗β-tubulin（1︰5 000），4 ℃孵育過夜。次日回收一抗，TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，在化學發光儀上進行顯影。采用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參基因灰度值。

1.3.6 免疫組織化學染色分析蛋白的表達水平 取乳腺癌組織，制成石蠟標本，并將其切片置于黏附性載玻片上，65 ℃烘烤1 h后進行脫蠟水化。加入EDTA緩沖液（pH=8.0）進行抗原修復。PBS洗滌3次，滴加3%H2O2滅活內源性過氧化氫酶。滴加3%BSA室溫封閉30 min后分別滴加一抗SASH1（1︰50）和Vimentin（1︰500），4 ℃過夜。次日滴加二抗孵育30 min，DAB避光顯色10 min。蘇木素染色30 s，鹽酸乙醇分色30 s，梯度乙醇和二甲苯脫水。最后，用封片劑封片晾干，顯微鏡下觀察陽性結果并拍照。染色強度和陽性百分比的標準化評分方案參照文獻［6］。（1）染色強度評分：0分（陰性）、1分（+）、2分（++）、3分（+++）。（2）染色陽性百分比評分：0分（陰性），1分（1%～20%），2分（21%～40%），3分（41～60%），4分（61%～80%），5分（81%～100%）。蛋白表達總分=陽性細胞染色強度評分×陽性細胞百分比評分。

1.3.7 SASH1敲低細胞系的建立 使用SASH1的慢病毒干擾載體感染處于對數生長期的T47D細胞作為SASH1敲低組，并設立對照組和病毒空載組。放入培養箱培養24 h后更換新鮮培養基。病毒感染48 h后觀察熒光表達情況。繼續培養24 h后收集細胞進行Western blot實驗。

1.4 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件分析數據。符合正態分布數據采用x±s表示，2組間均數比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法。相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SASH1與Vimentin相互作用的質譜分析 根據質譜數據進行生物信息學分析后的結果顯示，SASH1（O94885）的評分較高（200.3），共37條SASH1蛋白肽段，其中特異性肽段在總肽段中占比過半，為20條。Vimentin（P08670）的評分也較高（200.3），鑒定到141條肽段，其中51條為特異性肽段，而Vimentin與SASH1存在相互作用的可能性為100%。

2.2 免疫共沉淀實驗證實SASH1與Vimentin蛋白存在相互作用 免疫沉淀結果顯示，SASH1與Vimentin存在相互作用，見圖1。

2.3 SASH1和Vimentin在正常乳腺組織及乳腺癌組織中的表達 與正常乳腺組織相比，SASH1在乳腺癌組織中表達下調，而Vimentin在乳腺癌組織中表達上調，見表1，圖2、3。相關性結果顯示SASH1與Vimentin呈負相關（r=-0.664，P＜0.01）。

2.4 SASH1和Vimentin在正常及不同分子亞型乳腺癌組織中的表達 與正常乳腺組織相比，SASH1在4種乳腺癌亞型中的表達均下調，而Vimentin在4種乳腺癌亞型中上調，見表2。

2.5 乳腺癌組及癌旁組織中SASH1和Vimentin的表達 Western blot檢測結果表明，與癌旁組織相比，乳腺癌組織中SASH1表達降低，而Vimentin表達升高。見圖4、表3。

2.6 乳腺癌細胞中敲低SASH1對Vimentin表達的影響 Western blot檢測結果表明，與對照組和病毒空載組相比，SASH1敲低組中Vimentin的表達明顯上調，見圖5。

3 討論

乳腺癌的發病與年齡、雌激素、家族史、基因易感性等因素有關［7］。目前多種基因突變和異常蛋白表達參與了乳腺癌的發病機制。因此，可以通過研究乳腺癌相關基因及其發病機制來尋找新的抗癌藥物。

3.1 SASH1和Vimentin在乳腺癌組織中的表達情況 SASH1作為一種潛在的抑癌基因，在人體多種正常組織中廣泛表達并且發揮著重要的生理作用。目前對SASH1的研究主要集中在腫瘤領域。Meng等［8］證實SASH1在骨肉瘤組織中的表達顯著低于正常骨組織，在肺轉移患者的骨肉瘤組織中，SASH1 mRNA的表達水平顯著低于無肺轉移骨肉瘤患者。Zeller等［9］發現，在6個乳腺癌細胞系中，SASH1 mRNA的表達較正常乳腺細胞顯著降低。相反，過表達SASH1能明顯抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和EMT［10］。本實驗結果與上述研究結果一致。筆者發現與正常乳腺組織相比，SASH1在乳腺癌組織中表達降低；在不同分子亞型乳腺癌組織中SASH1的表達也低于正常乳腺組織，推測SASH1的低表達可能與乳腺癌的發生發展相關。Vimentin是一種重要的絲蛋白，廣泛存在于人體各種細胞中，其作用在于維持細胞的結構和機械強度。大多數癌癥中Vimentin過表達，如結腸癌［11］、宮頸癌［12］和肺癌［13］。Vimentin已被證明與多種蛋白質，如GlcNAc，p62相互作用，以促進多種惡性腫瘤的侵襲［14］。近年來研究表明，Vimentin在乳腺癌中也扮演重要角色，高表達Vimentin的乳腺癌細胞具有更強的侵襲和轉移能力［15］。在乳腺癌細胞中，使用小干擾RNA（siRNA）干擾Vimentin表達后，細胞的遷移能力被極大減弱［16］。本研究發現，與癌旁組織相比，乳腺癌組織中Vimentin的表達水平升高，這與文獻［11-13］報道一致，表明Vimentin可能是影響乳腺癌發生發展的重要因素。

3.2 SASH1和Vimentin存在負性調控 SASH1含有α-結構域和雞肉瘤病毒同源3結構域，在蛋白間相互作用中扮演重要角色［17］。而Vimentin是一種具有多種結合伙伴的功能蛋白［18］，作為經典的EMT生物標志物，在上皮細胞發生EMT期間被上調，并誘導間充質表型和運動行為［19］。本研究通過LC-MS/MS和免疫共沉淀實驗證實Vimentin和SASH1存在相互作用。此外，本研究還發現SASH1和Vimentin在乳腺癌組織中的表達呈負相關。用慢病毒將乳腺癌細胞中的SASH1敲低，結果顯示Vimentin的表達上調，表明SASH1可負性調控Vimentin的表達水平。有抑癌作用的SASH1在乳腺癌中低表達，并負性調節EMT的生物標志物Vimentin，提示兩者可能在乳腺癌的發生發展中發揮重要作用。

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（2023-01-13收稿 2023-04-25修回）

（本文編輯 李鵬）