淫羊藿苷-淀粉納米纖維的制備及其藥物釋放性能

郭文娟，邱 帥，李 楠，代 昭

（1.天津工業大學化學工程與技術學院，天津 300387；2.天津工業大學化學學院，天津 300387）

淫羊藿，又名仙靈脾，性味辛甘溫，有強筋健骨、補腎壯陽的藥效，始載于《神農本草經》，是一種擁有2 000 多年藥用歷史的傳統中草藥。淫羊藿苷（icariin，ICA）是提取自小檗科淫羊藿屬植物的一種黃酮苷類化合物，是淫羊藿的主要活性成分。現代藥理學研究表明，淫羊藿苷在神經、骨骼、心血管系統等方面能發揮良好的保護作用，還擁有較好的免疫調節、抗炎、抗衰老、抗腫瘤等藥理活性[1-2]。由于淫羊藿苷擁有良好的促軟骨生成[3]、修復骨缺損[4]、防治骨質疏松[5]、減輕骨關節炎等[6]功能，因此，經常被作為藥物用于組織工程領域。孫一丹[7]以β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）和聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）為基材，通過3D 打印制備了負載淫羊藿苷的復合支架，嘗試用于顱頜面部骨缺損，結果表明淫羊藿苷的加入提高了成骨效果。郭曉鵬等[8]采用物理共混法制備負載淫羊藿苷的絲素蛋白/納米羥基磷灰石水凝膠，經動物實驗后結果表明，負載有淫羊藿苷的絲素蛋白/羥基磷灰石水凝膠，可促進移植骨髓間充質干細胞增殖并分化為髓核樣細胞，增加細胞基質的合成，促進退變椎間盤的修復。

使用靜電紡絲法制備的納米纖維擁有三維空間交叉網絡，具有藥物的控釋接觸面積較大、網絡孔隙較易調控、制備簡單等特點，成為骨組織工程領域應用的新型熱點材料[9-10]。淫羊藿苷是優異的骨科藥材，納米纖維是優良的骨組織工程載體，但目前將二者結合起來的研究并不多。董志恒等[11]以淫羊藿苷為藥物，以聚己內酯為基材，通過靜電紡絲法制備了淫羊藿苷-聚己內酯納米纖維（直徑300～600 nm），結果表明，納米纖維之間形成了三維的網狀空間結構，且擁有良好的藥物緩釋性能和促成骨性能。

淀粉是最容易獲得的天然來源多糖材料之一，其加工過程簡單，成本低廉，生物親和性高、相容性好，經常與PVA、羥基磷灰石、β-磷酸三鈣等一起作為組織工程材料[12-13]。本研究采用淫羊藿苷為藥物，以可溶性淀粉為獨立基材，通過靜電紡絲法制備淫羊藿苷-淀粉納米纖維，對納米纖維的形成與淫羊藿苷的體外釋放進行研究，以期利用淀粉的高生物相容性與易獲得性，為淀粉與淫羊藿苷在骨組織工程的進一步應用奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

主要試劑：淫羊藿苷（純度96%）、可溶性淀粉（分析純），均為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產品；甲酸、25%戊二醛（分析純），均為天津市科密歐化學試劑有限公司產品；磷酸緩沖液（PBS，pH=7.4）、蘆丁標準品、甘氨酸，百靈威科技有限公司產品。

主要儀器：UV2600 型紫外分光光度計，日本島津公司產品；Gemini SEM500 型場發射掃描電子顯微鏡，德國卡爾蔡司股份有限公司產品；靜電紡絲儀，自制。

1.2 淫羊藿苷-淀粉纖維的制備

（1）淀粉納米纖維制備：甲酸不僅可以溶解淀粉，還對淀粉有酯化作用，破壞淀粉分子間的氫鍵和分子鏈剛性，促使淀粉充分溶解和結晶區的破壞，并引發淀粉分子在溶劑中進行分子鏈間的重排和糾纏，這對靜電紡絲是非常有利的，因此，可用于制備納米級淀粉纖維[14-15]。研究表明，使用靜電紡絲法制備淀粉納米纖維時，純溶劑的紡絲效果優于水混合溶劑[16-17]。準確量取一定量甲酸溶劑加入磨口錐形瓶中，加熱至30 ℃，按照質量配比精確稱量可溶性淀粉粉末，在磁力攪拌下仔細加入到溶劑中，10 min 內加入完成。用磨口瓶塞將錐形瓶密封，在集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中提升溫度至70 ℃，持續攪拌24 h 后，溶液完全溶解，得到無色透明的淀粉紡絲溶液。用注射器吸取5 mL 紡絲液，與靜電紡絲機一起放置于可控溫度與濕度的箱中，控制箱內環境為溫度40 ℃、相對濕度15%。穩定1 h 后，設置輥筒接收器轉速150 r/min，移動距離為170 mm，移動速率為900 mm/min。在不同紡絲液濃度、不同溶劑配比下進行靜電紡絲5 h，紡絲完成后從輥筒上取下所得納米纖維，于40 ℃真空烘箱中干燥24 h，獲得淀粉納米纖維。

（2）淫羊藿苷-淀粉納米纖維制備：按照不同淀粉/淫羊藿苷比例配置紡絲液，在最佳紡絲條件下制備載藥納米纖維。將上述所制備的纖維與盛有100 mL 25%戊二醛水溶液的燒杯同時放置于2 L 的密閉容器中，在常溫下戊二醛蒸汽揮發交聯24 h，然后用0.1 mol/L 的甘氨酸水溶液、PBS 磷酸緩沖液反復沖洗3次，得到淫羊藿苷-淀粉納米纖維。

1.3 性能測試與表征

（1）形貌表征：采用Gemini SEM500 型場發射掃描電子顯微鏡觀察納米纖維的外觀形貌。

（2）體外釋放量測試：準確稱取蘆丁標準品5.0 mg，配置質量濃度為0.01～0.50 mg/mL 標準液，使用UV2600 型紫外分光光度計在507 nm 處測量吸光度，得到標準工作曲線為：

式中：A為吸光度；C為質量濃度。精確稱取一定量的淫羊藿苷-淀粉納米纖維，將其放入盛有50 mL PBS緩沖液（pH=7.4）的100 mL 錐形瓶中，塞上磨口瓶塞并以封口膜密封，于37 ℃在恒溫氣浴搖床中以80 r/min 的速率振蕩。經過不同振蕩時間后取3 mL 上層溶液在507 nm 處進行定波長測量，根據標準工作曲線計算釋放量。

2 結果與討論

2.1 淀粉質量分數的影響

當紡絲電壓為20 kV、紡絲液推注速率為0.5 mL/h、接收距離為10 cm 時，改變紡絲液中淀粉的質量分數，所得淀粉納米纖維形貌如圖1 所示。

圖1 淀粉質量分數對淀粉納米纖維外觀形貌的影響Fig.1 Effect of mass fraction of starch on morphology of starch nanofibers

當淀粉濃度較低時，游離的溶劑較多，若溶劑在纖維成型過程中未能充分揮發，則可能對接收器上的纖維進行二次溶解和聚并，從而形成結塊或串珠；當淀粉濃度較高時，游離的溶劑較少，溶劑揮發難度增加，這將對泰勒錐的形成和劈裂成絲增加阻礙，因此，未能充分劈裂的液滴將直接噴射在接收器上，也將導致結塊或串珠[17]。由圖1 可以看出，淀粉質量分數為19%時成纖率較高，因此，后續采用19%作為淀粉基準質量分數，對其他條件進行優化以獲得更好的紡絲條件。

2.2 紡絲液推注速率的影響

當淀粉質量分數為19%、電壓為20 kV、接收距離為10 cm 時，不同紡絲液推注速率條件下所得淀粉納米纖維形貌如圖2 所示。

圖2 紡絲液推注速率對淀粉納米纖維外觀形貌的影響Fig.2 Effect of feed rate of spinning solution on morphology of starch nanofibers

由圖2 可以看出，隨著推注速率的增加，所得纖維增多；當推注速率為0.5 mL/h 時，所得纖維形狀較好，分布比較均勻；但當推注速率增加到0.7 mL/h 時，淀粉的結塊增加，表明此時溶劑的揮發還不完全。如要制備形態較好、直徑分布較窄的納米纖維，一個重要的因素是紡絲液的流延性和推注速率較為協調。較低的紡絲液推注速率將導致較多的溶劑揮發，紡絲液被拉伸的難度增加，導致生成纖維較少，纖維較細；但是若推注速率過快，溶劑揮發會顯著減慢，將導致纖維攜帶大量溶劑被直接噴射于接收器上，導致結塊或串珠[18]。

2.3 接收距離的影響

當淀粉質量分數為19%、電壓為20 kV、推注速率為0.5 mL/h 時，考察接收距離對淀粉納米纖維外觀形貌的影響，結果如圖3 所示。

圖3 接收距離對淀粉納米纖維外觀形貌的影響Fig.3 Effect of spinning distance on morphology of starch nanofibers

由圖3 可以看出，當針頭與接收器距離為16 cm時，所得納米纖維形態較好，所形成的串珠最少。由此可見，紡絲針頭與接收器的距離也是影響溶劑揮發的另一個重要因素[16]。當距離較短時，紡絲液溶劑未能完成有效揮發就被噴射至接收器表面形成結塊；當距離過遠時，溶劑揮發較快，纖維之間會互相聚集成塊被噴射到接收器上[16，18]。

2.4 電壓的影響

一般情況下，增大紡絲電壓，將減小納米纖維的直徑[19-20]。當淀粉質量分數為19 %、推注速率為0.5 mL/h、接收距離為16 cm 時，考察不同電壓對淀粉納米纖維外觀形貌的影響，結果如圖4 所示。

圖4 電壓對淀粉納米纖維外觀形貌的影響Fig.4 Effect of voltage on morphology of starch nanofibers

由圖4 可以看出，電壓為17 kV 時，所得纖維直徑范圍為0.12～0.79 μm，平均直徑為0.41 μm，36.7%的纖維直徑處于[0.3，0.4）μm，整體分布較寬；當電壓為18 kV 時，纖維直徑0.11～0.83 μm，平均直徑為0.34 μm，直徑處于[0.2，0.3）μm 和[0.3，0.4）μm 的纖維均約為33.3%，整體分散度變寬，隨著電壓增高，纖維的平均直徑變小；電壓為19 kV 時，所得纖維直徑范圍為0.17～0.60 μm，平均直徑為0.30 μm，纖維的平均直徑隨著紡絲電壓的增高繼續降低，直徑處于[0.2，0.3）μm的纖維約為46.9%，處于[0.3，0.4）μm 的纖維約為40.6%，整體呈現窄分布。

2.5 淫羊藿苷投入量的影響

以淫羊藿苷為藥物，在淀粉質量分數為19%、電壓為19 kV、推注速率為0.5 mL/h、接收距離為16 cm條件下，制備不同淫羊藿苷投入量的淀粉納米纖維，所得淫羊藿苷-淀粉納米纖維的SEM 照片與相應直徑分布如圖5 所示。

圖5 淫羊藿苷/淀粉質量比對納米纖維外觀形貌的影響Fig.5 Effects of mass ratio of icariin/starch on morphology of nanofibers

由圖5 可以看出，當淫羊藿苷/淀粉的質量比較低（4%）時，所得纖維直徑范圍為0.13～0.62 μm，平均直徑為0.27 μm，有58.06%的纖維直徑處于[0.2，0.3）μm，與未添加淫羊藿苷（圖4（c））相比，其纖維直徑范圍基本保持不變，但平均直徑有略微的減小，這表明少量淫羊藿苷的小分子加入對淀粉的成纖影響較少。當淫羊藿苷/淀粉的投入質量比增加到6%時，所得纖維直徑范圍為0.13～0.52 μm，平均直徑為0.28 μm，41.94%的纖維直徑處于[0.2，0.3）μm，處于此區間的纖維數量繼續減少，而直徑處于[0.1，0.2）μm 的纖維總量增加到25.81%。由此說明，淫羊藿苷用量增大，導致總體纖維的平均直徑繼續減小，這表明淫羊藿苷與溶劑之間的相互作用開始影響淀粉的分散狀態。當淫羊藿苷/淀粉的投入質量比增加到8%時，所得纖維直徑范圍為0.15～0.65 μm，平均粒徑為0.32 μm，有48.39%的纖維直徑處于[0.2，0.3）μm，但是從直徑分布圖上來看，纖維的直徑分布開始變寬，粗纖維有所增加，SEM 照片中顯示串珠出現，代表淫羊藿苷投入量的繼續增加對淀粉的良好分散產生了不良影響[21]。因此，從載藥量與纖維形態進行綜合考慮，淫羊藿苷質量為淀粉質量的6%時為最佳。

2.6 戊二醛交聯的影響

使用25%的戊二醛蒸汽交聯法對所得6%淫羊藿苷-淀粉納米纖維進行交聯，所得纖維的掃描電鏡照片與相應纖維的直徑分布如圖6 所示。

圖6 交聯淫羊藿苷-淀粉納米纖維SEM 照片及其直徑分布圖Fig.6 SEM photo and diameter distribution of crosslinked icariin-starch nanofibers

由圖6 可以看出，交聯后的纖維出現了收縮結節現象，交聯后的纖維直徑范圍為0.10～0.69 μm，平均直徑為0.31 μm。

2.7 淫羊藿苷-淀粉納米纖維的體外釋藥性能

在37 ℃下，在磷酸緩沖液（PBS，pH=7.4）中對交聯前后淫羊藿苷-淀粉納米纖維的體外釋放進行研究，結果如圖7 所示。

圖7 淫羊藿苷-淀粉納米纖維交聯前后的體外釋放曲線Fig.7 In vitro release profiles of icariin-starch nanofibers before and after crosslinking

由圖7 可以看出，淫羊藿苷從纖維中的釋放都存在突釋、緩釋和平衡3 個釋放階段。未交聯纖維的突釋期大約為2 h，淫羊藿苷的釋放量為45.5%；隨后進入了緩釋期，24 h 時的釋放量達到78.2%；隨后進入平衡期，168 h 時釋放量為96.12%。纖維交聯后，淫羊藿苷的釋放出現了明顯的緩釋性能，其突釋期也大約是2 h，釋放量為31.6%；隨后進入了較為平緩的緩釋期，大約一直維持到120 h，釋放量為62.6%；在平衡階段，168 h 時達到64.9%。這表明交聯可顯著降低淀粉的崩解速度，纖維主要發生溶脹，因此，有利于降低淫羊藿苷的釋放速率。

3 結 論

以甲酸為溶劑，以可溶性淀粉為基材，通過使用靜電紡絲法制備了負載淫羊藿苷的淀粉納米纖維，對淀粉納米纖維的制備規律進行了研究，結果表明：

（1）當淀粉質量分數為19%、電壓為19 kV、推注速率為0.5 mL/h、接收距離為16 cm 時能夠獲得纖維直徑分布較窄、形態較好的淀粉納米纖維，此時纖維直徑范圍為0.17～0.60 μm，平均直徑為0.30 μm，直徑處于[0.2，0.4）μm 的纖維約占87.5%，整體呈現窄分布。

（2）當淫羊藿苷質量為淀粉質量的6%時，能夠獲得形態較好的載藥纖維，纖維直徑范圍為0.13～0.52 μm，平均直徑為0.28 μm，41.94%的纖維直徑處于[0.2，0.3）μm。

（3）體外釋放研究結果表明，交聯可大幅增加載藥纖維的藥物緩釋性能，168 h 時只釋放了64.9%的淫羊藿苷。