基于網絡藥理學探討三芪丹治療2型糖尿病的作用機制*

邵紫欣,汪 何,莫 偉,姜開文,王霜玲,周 琳,畢建璐△

(1.廣州中醫藥大學,廣東 廣州 510000;2.廣東省第二中醫院,廣東 廣州 510095;3.南方醫科大學附屬南方醫院,廣東 廣州 510515)

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖是由胰島素分泌不足或其生物作用改變引起的,或兩者兼而有之。慢性高血糖可導致各種組織的慢性損傷,包括腎臟、眼睛、心臟、血管、神經和功能障礙。根據國際糖尿病控制聯盟(IDF)的數據,2019年全球約有4.6億成年人患有糖尿病。到2030年,這一數字預計將達到5.8億。超過90%的糖尿病患者患有2型糖尿病(T2DM)。T2DM主要表現為胰島素抵抗并發胰島素的相對不足,導致血糖水平升高,導致各種器官和組織慢性損傷,造成神經、血管、腎臟疾病以及其他糖尿病并發癥,可能引起重病患者死亡[1]。T2DM的發病機制尚不清楚。經過對T2DM的廣泛研究,中醫在治療T2DM及其并發癥方面逐漸顯示出獨特的優勢。尋求安全、有效、無不良反應的傳統天然植物正逐漸成為T2DM研究的“熱點”[2]。

T2DM屬于中醫“消渴”的范疇,其病位在肺,胃,腎,主要病機陰津虧損,燥熱偏盛[3]。消渴病陰虛內熱,耗傷津液,進而導致血行不暢、血脈瘀滯。三芪丹針對T2DM “氣陰兩虛,瘀血阻滯”的病理環節,遵循中醫益氣養陰,活血化瘀的治法原則,主要針對氣陰兩虛,瘀血阻滯所致口干多飲善饑,小便頻數,疲倦乏力,腰膝酸軟等[4]。三芪丹的主要藥物組成為三七,黃芪,丹參,桑椹。三七是五加科植物三七的干燥根和根莖,能夠化瘀止血、活血定痛。相關研究表明,三七對T2DM模型大鼠具有降血糖、提高胰島素抵抗和減少并發癥的功用[5]。黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根。黃芪為甘溫之品,歸于肺經、脾經,具有補氣升陽、生津養血、利水消腫等功效。有研究表明單味黃芪可以提高T2DM患者的胰島素抵抗、減弱早期胰島β細胞損害[6]。丹參味苦、微寒,祖國醫學認為丹參可活血祛瘀、清心除煩、通經止痛、涼血消癰。有研究表明,丹參在降低血糖水平方面有很好的效果,臨床證實了丹參治療糖尿病及其并發癥的功效[7]?！吨袊幍洹酚涊d桑椹可以補血滋陰,生津潤燥,1988年國家衛生部將桑椹列為藥食同源植物,被稱為“21世紀的最佳保健果品”,是一種治療高血壓、高脂血癥和糖尿病的特殊藥食兩用植物,得到了國內心血管病專家的一致評價。本文旨在通過對三芪丹進行網絡藥理學分析,為T2DM的治療提供進一步的方法依據和機制,從三芪丹的有效化合物、有效化合物和靶點以及靶點和疾病之間的機制進行分子水平的細化?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 藥物靶點的篩選 應用中藥系統藥理學技術平臺(TCMSP)[8]找到三七,黃芪,丹參,桑葚的中藥成分,并根據口服生物利用度(OB)≥30%,藥物相似性(DL)≥0.18 篩選出主要化合物和靶點。

1.2 疾病相關靶點的篩選 通過GeneCards數據庫和TTD數據庫以“Type2 diabetes”為關鍵詞進行檢索,獲得T2DM相關的疾病靶點,并應用Uniprot數據庫對疾病靶點進行標準化,獲得Uniprot ID。將三芪丹主要化合物靶點與疾病靶點通過Venny2.1軟件繪制韋恩圖取交集,得到三芪丹治療T2DM的潛在作用靶點。

1.3 藥物-疾病靶點網絡構建 將篩選得到的藥物-疾病共同靶蛋白在STRING 11.0平臺構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡模型,將蛋白質種類設置為“Homo sapiens”,置信度為:highest confidence(0.900),其他參數保持默認設置,獲得PPI網絡。將獲得的蛋白互作網絡導入Cytoscape3.7.2[9]中構建藥物主要化合物-靶點的可視化網絡,并利用Cytoscape的CytoHubba中Maximal Clique Centrality(MCC)拓撲分析方法得到三芪丹治療T2DM前10位的關鍵靶點。

1.4 功能富集分析及“成分-靶點-信號通路”網絡構建 采用RStudio及metascape數據分析網站分別分析三芪丹治療T2DM相關靶點的基因功能及代謝通路。利用得到的藥物-疾病靶基因進行GO(Gene ontology)生物過程富集分析和KEGG(KEGG pathway analysis)代謝通路富集分析(選擇P≤0.05),分析三芪丹治療T2DM的信號通路和生物過程。最后應用Cytoscape軟件構建三芪丹主要成分-靶點-信號通路網絡拓撲圖。

2 結果

2.1 三芪丹主要化合物和靶點的篩選 利用TCMSP數據庫找到三七,丹參,黃芪,桑椹的中藥成分,并根據口服生物利用度(OB)≥30%,藥物相似性(DL)≥0.18 篩選出主要化合物99個,其中三七8個,丹參65個,黃芪20個,桑椹6個,刪除重復項后得到97個主要化合物,見表1(按OB值大小排列,藥物僅列出排名前4位的化合物)。將主要化合物輸入TCMSP數據庫查詢得到潛在作用靶點,經Uniprot數據庫匹配后得到對應靶點314個(已去除重復項)。

表1 三芪丹主要化合物表

2.2 三芪丹治療T2DM的潛在作用靶點 通過TTD數據庫和GeneCards數據庫進行檢索,獲得T2DM相關疾病靶點172個(已去除重復項)。將314個三七,丹參,黃芪,桑椹成分靶點與172個T2DM靶點輸入Venny2.1軟件繪制韋恩圖,兩者取交集后獲得三芪丹與T2DM共同靶點18個,見圖1。

圖1 三芪丹與T2DM共同靶點韋恩圖

2.3 網絡構建與分析

2.3.1 PPI網絡構建 利用STRING在線數據輸入18個潛在靶點,分析后得到PPI網絡圖,見圖2,圖中

圖2 三芪丹潛在靶點的 PPI 網絡圖

含有18個靶蛋白和40條互作邊。將PPI數據導入Cytoscape3.7.2軟件中,利用CytoHubba插件中的MCC算法篩選最重要10個關鍵基因,見圖3。這些關鍵基因包括過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、轉化生長因子β-1(TGFB1)、磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)、NAD依賴蛋白去乙酰酶(SIRT1)、白介素-1β(IL1β)、受體酪氨酸蛋白激酶(ERBB2)、干擾素-γ(IFNG)、SLC2A4、雄激素受體(AR)、間隙連結α-1(GJA1)。

2.3.2 三芪丹主要化合物-治療靶點網絡 通過Cytoscape軟件構建三芪丹主要化合物-靶點網絡,merge后得到79個節點,171條邊,見圖4。從圖4可知,一個化學成分常與多個交集基因靶點對應,且一個交集基因與靶點也同時對應多個化學成分,化學成分又從屬于不同的中藥,這說明三芪丹治療T2DM是通過多成分、多靶點、多通路起效的。以“degree”排序后得到,有效成分槲皮素、木犀草素、二氫丹參內酯、刺芒柄花素、山柰酚和靶點PTGS1、DPP4、AR、DRD1、PPARG、PIK3CG。

圖4 三芪丹主要化合物-靶點網絡圖

2.4 功能富集分析

2.4.1 GO富集分析 基于Bioconductor中的R包對18個潛在靶點進行基因本體論(GO)功能富集分析。富集條件為P valueCutoff=0.05且Q valueCutoff=0.05,其他項目默認原始設置。共得生物過程(biological process,BP)1214個,分子功能(molecular function,MF)31種,細胞組成(cellular component,CC)4種,共1249條信息。其中GO富集生物進程分析中交集基因主要參與了對肽激素的反應、RNA分解代謝、肽的細胞反應、mRNA分解代謝過程等生物過程,見圖5。

圖5 三芪丹-T2DM潛在靶點的生物功能分析

2.4.2 KEGG信號通路富集分析 KEGG通路富集通路(P<0.05),主要涉及癌癥通路、破骨細胞分化、foxo信號通路、PPAR信號通路、胰島素抵抗等,選擇前9個進行圖形展示,結果見圖6,提示可能是三芪丹-T2DM的主要生物學功能及作用機制。

圖6 三芪丹-T2DM潛在靶點的KEGG通路富集分析結果

2.5 “成分-靶點-信號通路”網絡構建 將三芪丹治療T2DM的61個潛在成分,18個關鍵靶點蛋白及KEGG信號通路富集分析的前9條通路制作“成分-靶點-通路”的網絡關系表,將其導入Cytoscape 3.7.2軟件,構建出三芪丹治療T2DM的“成分-靶點-通路”網絡圖,見圖7。體現了三芪丹中“多成分-多靶點-多通路”對T2DM起到綜合治療作用的特點。

圖7 三芪丹治療T2DM的“成分-靶點-通路”網絡圖

3 討論

T2DM是一種慢性代謝疾病,主要是由于相對缺乏胰島素和胰島素抵抗。本研究發現,槲皮素、木犀草素、二氫丹參內酯、刺芒柄花素、山柰酚是三芪丹最重要、最有效的化合物,過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、轉化生長因子β-1(TGFB1)、磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)、NAD依賴蛋白去乙酰酶(SIRT1)、白介素-1β(IL1β)是三芪丹治療T2DM的關鍵靶點。大量研究表明槲皮素具有氧化、抗炎、降低血糖等多種生物活性,可在糖尿病防治中發揮作用。槲皮素、山柰酚、木犀草素均屬于黃酮類化合物,有實驗表明,補充槲皮素有利于降低糖尿病大鼠的血糖濃度,促進胰島β細胞的恢復并增加胰島素的釋放[10]。其作用機制可能是由于槲皮素皮質激素有助于增加胰島素受體數量,刺激胰腺β細胞再生,修復胰腺氧化損傷,清除自由基,抑制脂質過氧化,改善氧化劑-抗氧化劑以維持正常糖之間的平衡[11]。山柰酚不僅能降低血脂和血糖,保護胰島素的細胞功能,提高胰島素抵抗力,還可以保護糖尿病微血管病變[12]?，F代藥理學研究表明,木犀草素能顯著改善脂質含量升高引起的大鼠胰島素抵抗模型,具有抗T2DM的活性[13-14]。木犀草素對實驗動物血糖活性增強,可顯著提高T2DM對胰島素的抵抗力[15]。有研究表明刺芒柄花素作為一種多酚類化合物,激活PPARγ通道調節血脂代謝[16-17]。在動物實驗中,刺芒柄花素可以降低胰島素抵抗力,改善糖尿病大鼠的血糖和脂質水平,降低T2DM血糖水平,可能由于SIRT1在胰腺組織中的表達增加[18]。二氫丹參內酯是丹參T2DM的關鍵化合物,二氫丹參內酯在T2DM中治療中的相關研究較少。

在三芪丹作用T2DM的18個靶點中,Degree最高的靶點分別是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、轉化生長因子β-1(TGFB1)、磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)、NAD依賴蛋白去乙酰酶(SIRT1)、白介素-1β(IL1β)。T2DM的發生機制可能與磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)、NAD依賴蛋白去乙酰酶(SIRT1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)等相關。PPARG在脂肪細胞的分化、脂肪細胞異質基因的表達以及胰島素敏感性的調節中起著重要作用,或許參與T2DM對脂肪紊亂的調節[19]。研究表明,PTEN參與調節胰島素T2DM P3K-AKT信號傳導通道,在T2DM出現之前發生了變化,這可能是T2DM早期生化檢測的指標[20]。SIRT1是一種多功能的轉錄調節因子,通過使多種控制代謝及內分泌信號的轉錄因子脫乙?；{節其活性,調節身體的能量平衡,維持體內糖的穩定代謝[21]。

通過對核心靶蛋白進行GO和KEEG通路富集分析,三芪丹治療T2DM中涉及多個生物過程和多個通路的共同協調作用。筆者發現三芪丹對治療 T2DM的靶點可能包括以下四類機制:(1)破骨細胞分化。(2)foxo信號通路。(3)PPAR信號通路。(4)胰島素抵抗。破骨細胞分化是導致T2DM骨質疏松癥,血糖、胰島素、去卵巢、雌激素等缺乏的原因之一[22],有研究表明,在糖尿病骨質疏松患者體內破骨細胞通過激活ROS/MAPKs/NF-ΚB/NLRP3炎癥通路以及抑制胞葬作用發生介導骨吸收能力的增強是糖尿病性骨質疏松的主要發病機制[23]。foxo信號傳導通路,FOXO在調控糖脂代謝、細胞周期和氧化應激中起著重要作用,主要通過轉錄控制和信號傳遞[24],foxo在調節糖尿病、腫瘤等多種復雜疾病中發揮重要作用。foxo是通過PI3K通道激活的,PI3K通道通過生長因子作用激活,可導致磷酸化AKt激活,磷酸化的foxo激活或抑制細胞凋亡或細胞分裂周期相關基因,如FasL,Bcl26,TRAIL,FLIP等,要么促進凋亡,要么抑制凋亡[25]。已有研究證明foxo3a轉錄因子在內皮細胞中通過PI3K/Akt/foxo3a途徑調節內皮細胞凋亡。過氧化物酶增殖激活受體(PPAR-λ)是與糖尿病及脂質代謝密切相關的基因,與其下游解偶聯蛋白2(UCP2)-腺苷酸活化激酶 AMPK-ACC信號通路共同參與肝臟相關脂質代謝的調節[26]。實驗表明,PPAR信號通路與糖脂代謝相關,電針通過PPAR-γ/UCP2-AMPK-ACC信號通路調節脂質代謝,提高T2DM大鼠體內胰島素抵抗力[27]。

本研究通過中藥活性成分分析、靶向預測,分析T2DM治療的相關機制,通過網絡模擬分析,從“藥物-靶點-疾病”的相關性以及槲皮素、木犀草素、山萘酚等多種活性成分的測定,影響破骨細胞分化、foxo信號通路、PPAR信號通路、胰島素抵抗等,發揮調控糖脂代謝、提高胰島素敏感性、提高胰島素抵抗等作用。本研究發現三芪丹治療T2DM呈現出的多分子、多靶點協同作用優勢明顯,并為進一步拓展研究提供了臨床方法論和理論依據。