針刺對腦梗死大鼠骨骼肌vimentin、desmin基因表達的影響*

楊光至,劉梅芳,施 靜△,張如意,馮斯峰,徐連杰,趙曉慶,王 敏,王嘉輝

(1.云南省中醫醫院,云南 昆明 650021;2.云南中醫藥大學,云南 昆明 650500)

腦梗死已成為威脅人類健康的重大疾病[1],腦梗死導致的上運動神經元損害表現多樣,偏身骨骼肌肌力減弱是腦梗死患者骨骼肌的變化之一,在骨骼肌收縮過程中,Vmentin及desmin在維持肌肉細胞的骨架及細胞骨架的完整程度方面亦有一定作用。有研究運用無標記質譜聯用比較免疫印跡技術,能夠在肌肉受損及肌肉的輕度退化中的對比鑒定出vimentin等蛋白的顯著改變[2],對研究小鼠肌肉收縮功能恢復與Vmentin的關系提供了佐證。desmin為中等徑細胞骨架纖維,對細胞結構的支撐、細胞形狀的決定及細胞機械強度的賦予等有重要作用[3]。高張力的機械牽拉會使細胞骨架的正常結構受到影響,進而造成肌肉收縮蛋白的結構破壞[4-6]。故在本研究中選取以上2個基因觀察針刺介入治療后mRNA的表達情況。本實驗在建立腦梗死大鼠模型的基礎上,運用qRT-PCR檢測法,觀察針刺對腦梗死大鼠不同骨骼肌中vimentin及desmin基因的表達,以期進一步探討針刺治療腦梗死的機制。

1 資料與方法

1.1 動物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重120 g,清潔級,共100只,由浙江省實驗動物中心提供,并在本中心完成動物實驗,大鼠生產許可證:SCXK(浙)2014-0001;大鼠使用許可證:SYXK(浙)2014-0008,實驗前適應性喂養1周,飼養于溫度18～26℃、濕度55%的環境中,自然光照。對動物的各項處理方式均按當地動物管理委員會相關倫理學規定進行。

1.2 主要試劑 Trizol柱純化總RNA試劑盒(simgen)、Fast 1st strand cDNA Synthesis Kit(with gDNase)(simgen)、2×SYBR Green PCR Mix(simgen)、50×ROX Reference Dye(simgen)。

1.3 主要儀器 水浴鍋(XMTD-6000,上海宜昌儀器紗篩廠);離心機(5452,德國eppendorf股份公司);ABI PRISM?7000熒光PCR儀(7000,美國ABI公司);漩渦振蕩儀(XH-C,金壇市醫療儀器廠)。

1.4 模型制備 采用孟宜良的線拴法制作大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血模型[7],造模后的動物在自然蘇醒后,參照Zea-Longa的5級評分標準對其障礙進行評分[8],篩選合格模型進行實驗。

1.5 動物分組與處理 按隨機數字表法分為:A組(頭部穴位組)、B組(軀體穴位組)、C組(頭部+軀體穴位組)、D組(模型組)、E組(空白組),每組20只,組內再按隨機數字表法分為0、24、48 h組,每組5只。五組大鼠均正常喂養。

1.6 針刺方法 取穴和針刺手法參照華興邦等研制的《大鼠穴位圖譜》[9],選取“百會”、“風府”、“大椎”、“前三里”、“后三里”等穴。針刺操作:“百會”向后斜刺2 mm,“風府”向下方斜刺2 mm,“后三里”直刺7 mm,“前三里”直刺5 mm,“環跳”直刺7 mm,“后會”斜刺2 mm,“陽陵泉”直刺5 mm。針具選用佳健牌25號1寸一次性無菌針灸針;進針后捻轉1 min,平補平瀉,每次留針30 min。

1.7 取材與檢測方法 各組針刺治療結束后,在對應時間點處死大鼠,取下前肢肌、腓腸肌針刺局部的骨骼肌,放入液氮中,隨轉移到-80℃冰箱中保存待測。采用反轉錄酶對提取的RNA進行反轉錄處理;采用聚合酶及引物對反轉錄的RNA進行qRT-PCR檢測。

采用定量法提取大鼠骨骼肌組織進行異丙醇處理:(1)RNA提取:將大鼠骨骼肌標本按Trizol試劑盒(simgen)操作說明提取RNA。(2)合成cDNA:將提取得到的RNA,各取2μg用于反轉錄,按照說明操作,-20℃凍存。(3)PCR擴增:以一個樣本的cDNA稀釋后作為標準品做基因的定量PCR,擴增條件為95℃,1min變性,95℃,5s,60℃,33s,共40個循環,最后是72℃,10min延伸。(4)引物:vimentin正向引物5’-TGAGATCGCCACCTACAGGA-3’5’-ACAATGCTTCTCTGGCAC GTCT-3’;desmin正向引物5’-TCACTCAACGAGGAGATTGCAT-3’5’-CATTGAGACCCGGGATG GAG-3’;內參β-actin 正向引物5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’5’-TTTAATGTCACGCACGA TTTC-3’。(5)使用實時熒光定量PCR檢測。反應結束后,根據測得的樣品閾值(Ct)及標準曲線,求出待測樣品的相對起始濃度,用目的基因的相對起始拷貝數除以相應的β-actin的相對起始拷貝數得到目的基因表達的相對值。

2 結果

大鼠骨骼肌中vimentin及desminA的qRT-PCR產物均出現非特異性擴增,并且擴增產物符合設計長度。以樣本cDNA稀釋后求得的β-actin的擴增標準曲線斜率為-3.366,相關系數為-0.996,模板濃度對數值與Ct之間呈良好的線性關系。

2.1 前肢肌中vimentin的表達 見表1,結果顯示,與模型組比較,三個治療組中vimentin的mRNA表達量均有明顯變化,頭部穴位加軀體穴位治療組在0、24 h有顯著性差異(P<0.001),較其余組別呈明顯上調。軀體穴位組在0、24 h有顯著性差異(P<0.001),表達量相對上調。

表1 前肢肌vimentin的mRNA表達比較

表2 腓腸肌中vimentin的mRNA表達的比較

2.2 腓腸肌vimentin的表達 結果顯示,與模型組比較,三個治療組中vimentin的mRNA表達量均有明顯變化,頭部穴位組加軀體穴位治療組在0 h有顯著性差異(P<0.001),較頭部穴位組及軀體穴位組表達量相對上調。軀體穴位組在24 h有顯著性差異(P<0.05),表達量明顯增高。模型組在0、24、48 h有顯著差異(P<0.001),表達量在48 h時呈顯著上調。

2.3 前肢肌中desmin的表達 表3結果顯示:三個治療組中desmin 的mRNA表達量均有明顯變化,軀體穴位組在0、24、48 h有顯著差異(P<0.001),表達量呈現上調。頭部穴位組在0、48 h均有顯著性差異(P<0.05),表達量在0 h相對上調。模型組在0、48 h有顯著差異(P<0.001),在48 h時表達量呈相對上調。

表3 前肢肌中desmin基因表達的比較

2.4 腓腸肌中desmin的表達 表4結果顯示:與模型組比較,三個治療組中desmin的mRNA表達量均有明顯變化,頭部穴位組加軀體穴位組在48 h有顯著性差異(P<0.001),表達量較其他組別呈現相對升高。軀體穴位組在0、24 h有顯著性差異(P<0.05),表達量均呈現相對上調。模型組在0、24、48 h有顯著差異(P<0.001),48 h時表達量較之前明顯上調。

表4 前肢肌中desmin的mRNA表達的比較

3 討論

《素問·骨空論》曰“督脈者,起于少腹……貫脊屬腎……與太陽起于目內毗,上額交巔上,入絡腦……”《難經·二十八難》曰“督脈者起于下極之俞,并于脊里,上至風府,入屬于腦貫脊屬腎;《十四經發揮》曰“陽之海者,以人是脈絡,周流于諸陽之分……而督脈為之都綱,故曰陽脈之海。”督脈是陽脈之海,能溝通陰陽,調節陽經脈氣,總攝諸經,為經脈之海,且能對腦的功能起到調節作用。膀胱經、督脈經都具有通行陽氣的作用。陽氣在人體中起著重要的作用,循經達表,可以衛外防御邪,通達于內,濡養臟腑,溫通經脈……中風病病變在腦部,以全身骨骼肌癱瘓等為臨床主要癥狀,而癱瘓肌群是督脈和膀胱經脈所通過之處,經絡所過,主治所及,故取督脈及膀胱經的腧穴能升陽通督,改善全身骨骼肌肌力。許能貴等[10-11]通過電針大鼠局灶性腦缺血模型的督脈穴大椎、百會,發現電針可糾正腦缺血后中樞單胺類遞質的代謝紊亂,進而保護腦缺血性損害。易瑋等[12]研究發現腦缺血大鼠在針刺大椎、百會后,局部腦血流量迅速恢復,從而保護神經元缺血性損傷。綜上所述,無論是現代研究及古代的醫家經驗均證實了督脈經穴和膀胱經穴在中風病治療中的重要作用,故本研究以督脈的風府,百會為主穴,觀察腦梗死大鼠癱瘓骨骼肌中vmentin及desimin的mRNA表達,以研究以督脈及膀胱經穴為主治療中風病的癱瘓骨骼肌的分子機制。

根據“治痿獨取陽明”的理論。以及現代研究,宿寶貴等[13]觀察到針刺足三里、曲池穴后在活體MRI下,大鼠的腦梗死區域面積較對照組明顯變小,且在電鏡下觀察到針刺足三里可使腦梗死邊緣區神經細胞的線粒體腫脹和嵴的損傷均比對照組輕微,提示針刺足三里可以對神經元提供保護作用。 故本實驗選取陽明經的“前三里”和“后三里”觀察針刺對腦梗死大鼠骨骼肌的分子機制。

研究結果顯示:以督脈為主的頭部穴位+軀體穴位組,在腦梗死大鼠的前肢肌vimentin的表達量較其他組別在0、24 h出現了相對上調,故頭部穴位加軀體穴位的早期針刺介入治療可能對腦梗死后骨骼肌的修復有一定作用;軀體穴位組較其他組別在0、24 h時desmin及vimentin的表達明顯上調。提示可能以軀體穴位的局部取穴為主的針刺,在維持局部骨骼肌細胞骨架的完整性及修復細胞骨架的方面較其他針刺方式效果更明顯;頭針組在0、24、48 h的desmin及vimentin的表達量均呈現上調;提示針刺頭部督脈經穴,可能對于提高中樞腦組織的修復具有積極的作用,腦組織的修復的同時增強了骨骼肌的肌力恢復。

在研究中,筆者也觀察到,模型組在各骨骼肌肌群中,vimentin、desmin的mRNA表達量在48 h時上調的幅度相對較明顯,可能說明,在無針刺介入的情況下,骨骼肌正常細胞骨架可能具有自我修復的功能,提示可能針刺介入時間越早,對于骨骼肌細胞骨架及完整性的修復更具意義。

研究結果提示針刺改善腦梗死偏癱骨骼肌肌力的機制可能是通過針刺對外周效應器的局部刺激,在改善局部功能的同時,引起中樞腦組織的修復,從而增強了外周效應器的康復,證實外周-中樞-外周的部分作用機制。