嗅三針對血管性癡呆大鼠海馬CA1區損傷及Keap1/Nrf2/ARE信號通路關鍵蛋白的影響

李 杰,王 強,2,王 淵,劉雋陽,郭 婕,李 華,牛文民,張安仁

(1.陜西中醫藥大學,陜西 咸陽 712046;2.陜西省針藥結合重點實驗室,陜西 咸陽 712046;3.同濟大學附屬上海市第四人民醫院,上海 200434)

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是由各種血管因素發生病理變化引起的腦組織損害,臨床常表現為認知、學習、記憶等功能障礙,給患者的日常生活、工作帶來極大不便[1]。本團隊在多年的研究中發現,嗅三針對癡呆的癥狀有較好改善作用,而其作用機制需進一步闡明,故開展本次研究工作。本次以VD模型大鼠為研究對象,從VD早期出現的氧化應激著手,圍繞VD早期出現的抗氧化kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)/核因子E2相關因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 ,Nrf2) /抗氧化反應元件(AU-rich element,ARE)信號通路展開研究,探索嗅三針治療VD的分子機制,為治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑與儀器:戊巴比妥鈉(批號57432),伊紅、蘇木(批號c0109、c0107),二甲苯(批號534056),中性樹膠(批號YSQN41)。RIPA裂解液、蛋白Marker、Bradford蛋白濃度試劑盒(上海碧云天公司),PVDF膜(Immobilon-PSQ公司),Nrf2抗體(批號AF0639),HO-1抗體(批號AF5383),NQO1抗體(批號DF6437),山羊抗兔(批號GB21303),ML385(批號S8790)。華佗針、韓式電針儀(蘇州醫療用品有限公司),顯微鏡、全能型成像分析系統、PH計(BIO-RAD公司),灰度分析軟件(Alpha Innotech公司),冰凍切片機(HM525 NX UV公司),正置熒光顯微鏡(Thermo Scientific公司)。

1.1.2 實驗動物:選擇雄性SD大鼠,平均體重(200±20)g,購自西安交通大學動物實驗中心,飼養于陜西中醫藥大學動物實驗中心動物房。飼養房間室內溫度22～24 ℃,濕度為60%～70%,光暗周期為12 h,設置自動亮燈時間段為08:00～20:00、滅燈20:00～8:00,通風系統保持良好。待大鼠到達實驗室,適應性喂養1周后,開展后續實驗。定期喂養,及時更換墊料,操作中輕柔抓取和觸摸,使大鼠能夠較早適應抓取操作。采用Morris水迷宮實驗檢測,剔除不合格大鼠,將符合條件的大鼠隨機分為假手術組、模型組、嗅三針組、抑制劑組,每組15只。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法:大鼠術前禁食12 h,禁水4 h,根據體重選用適量的2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。待麻醉后,固定大鼠,消毒,沿頸部中線切開皮膚,用鑷子撕開皮下組織,運用玻璃分針分離雙側頸總動脈、周圍神經,暴露雙頸總動脈。用玻璃分針挑起頸總動脈,分離附著的神經及膜組織,兩端結扎,從結扎處中間剪斷頸總動脈,另一側運用同樣操作方法,0.9%氯化鈉溶液沖洗傷口,用頭孢青霉素沖洗處理,縫合皮膚[2]。VD主要表現為認知功能降低,將認知學習、空間記憶、空間識別作為檢測指標,采用Morris水迷宮測試方法,記錄大鼠逃避潛伏期,并與假手術組做比較,計算其差值占該鼠逃避潛伏期的比例,比值大于20%為癡呆[3-4]。

1.2.2 針刺干預方法:針刺干預采用的是嗅三針帶電治療,簡稱為“嗅三針”。嗅三針的穴位為雙側迎香、印堂,根據《實驗針灸學》[5]大鼠穴位定位圖譜,迎香穴位于大鼠鼻孔外側上端,有毛與無毛交界處,印堂穴位于大鼠兩眼眶上緣中點連線與正中線交點。電針方法:迎香穴向內上方斜刺2～3 mm,印堂向鼻根平刺2～3 mm;正極接印堂,負極接一側迎香,刺激10 min,負極換接另一側迎香,刺激10 min。刺激參數:疏密波,頻率為2/15 Hz,強度為1 mA,1次/d,5 d為1個療程,休息2 d,共4個療程。運用特制的大鼠固定袋、固定架固定實驗大鼠,假手術組大鼠在相同時間采用相同程度的捉抓刺激,運用固定架固定20 min。

1.2.3 ML385配置及應用方法:ML385為Nrf2的靶向抑制劑,配置時稱取ML385粉末,將其溶解在純DMSO中配制成原液(即母液),母液濃度為40 mg/ml,適當加入PBS稀釋成5%溶液,在37 ℃水浴鍋中加熱至完全溶解。按照體積比加入其他溶劑,具體配方為:5%母液、40%的PEG300、5%的Tween80、50%的PBS;配置工作液濃度2 mg/ml。將配置好的ML385腹腔注射于大鼠,用量30 mg/(kg·d)。

1.2.4 各組干預方法:假手術組大鼠打開皮膚,暴露雙側頸總動脈,縫合;模型組大鼠采用雙側頸總動脈結扎術制備VD模型;嗅三針組大鼠在VD造?；A上,加嗅三針帶電治療,具體見1.2.2;抑制劑組大鼠在VD造?；A上,加抑制劑ML385,具體用法見1.2.3。

1.2.5 Morris水迷宮實驗檢測大鼠行為學:定位航行實驗歷時5 d,正式測試前1天的測試為大鼠適應性訓練,使大鼠熟悉水迷宮房間環境,大鼠在水迷宮中游泳探索尋找水下隱匿目標平臺,以水池周圍的空間環境,池壁上不同形狀、顏色標識物作為參照對象,對迷宮水下目標平臺空間位置做一對比識別記憶,大鼠下水后,快速找到目標平臺,記錄找到并登上目標平臺的時間,即逃避潛伏期。以大鼠逃避潛伏期評價不同組別大鼠學習和空間記憶能力。

1.2.6 HE染色大鼠海馬CA1區組織:各組大鼠干預療程完成后,取材,固定,包埋,切片,經過脫蠟,染色,脫水,封片,拍照,顯微鏡下觀察并拍照采集圖像。

1.2.7 Western blotting檢測大鼠海馬組織HO-1、NQO1蛋白表達:組織總蛋白提取、測定和變性,電泳,轉膜,免疫反應,化學發光。

1.2.8 免疫熒光法檢測海馬CA1區Nrf2活化情況:將組織切片,脫蠟,抗原修復,封閉,加抗體,DAPI復染,淬滅,顯微鏡下觀察并拍照采集圖像。

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學表現比較 假手術組大鼠狀況良好,反應靈敏,毛發整齊潤滑,進食、進水均正常。模型組、抑制劑組大鼠造模完成后3 d內狀況較差,反應遲鈍,行動緩慢,毛發無光澤,進食、進水較少,3 d后狀態逐漸恢復,行動逐漸敏捷。嗅三針組大鼠造模完成后3 d內狀況較差,似于模型組,15 d后與抑制劑組、模型組大鼠比較,精神狀態明顯較好。

2.2 各組大鼠定位航行、空間探索軌跡比較 見圖1、2。各組大鼠在Morris水迷宮實驗中的逃避潛伏期、空間探索軌跡不同。模型組、抑制劑組大鼠尋找目標平臺游泳的距離大于假手術組、嗅三針組;空間探索試驗結果中,假手術組、嗅三針組穿越平臺區次數、平臺區游泳距離明顯多于模型組、抑制劑組。

圖2 各組大鼠空間探索軌跡比較

2.3 各組大鼠海馬區病理形態學比較 見圖3。顯微鏡下觀察海馬CA1區細胞,假手術組CA1區組織形態結構清晰,細胞排列整齊,輪廓清晰;模型組細胞排列紊亂,間隙增大,壞死數量增多,核固縮增多;與模型組比較,嗅三針組細胞形態結構清晰,排列較整齊,核仁清晰;與嗅三針組比較,抑制劑組細胞排列不齊,數目減少,分布不均,核固縮增多,邊界不清晰。

2.4 各組大鼠 Nrf2蛋白表達比較 見圖4。顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區細胞Nrf2蛋白表達情況,假手術組有少量表達,模型組、抑制劑組有部分陽性表達,嗅三針組有強陽性表達。對各組圖像進行對比分析,與假手術組比較,模型組海馬CA1區Nrf2蛋白增加;與模型組相比,嗅三針組Nrf2蛋白增加;與抑制劑組相比,嗅三針組Nrf2蛋白表達增加。

2.5 各組大鼠海馬組織HO-1、NQO1蛋白表達比較 見表1(圖5)。假手術組大鼠海馬組織HO-1、NQO1有一定的表達,而模型組表達高于假手術組,這是機體自我保護作用。嗅三針組大鼠海馬組織HO-1、NQO1表達高于模型組、抑制劑組,這是在針刺干預下保護機制的增強表現。

表1 各組大鼠HO-1、NQO1蛋白相對表達量比較

圖5 各組大鼠海馬組織HO-1、NQO1蛋白電泳圖

3 討 論

《素問·四氣調神論篇》:“是故圣人不治已病治未病,不治已亂治未亂,此之謂也”,明確提出了要把疾病控制在萌芽階段,阻止或延緩疾病的發展進程,即治未病理念[6-7]。本團隊學術帶頭人牛文民、劉智斌教授多年來致力于癡呆研究,基于治未病的“既病防變”理論,運用針灸干預癡呆早期出現的主要癥狀,以嗅覺功能障礙為切入點,最終延緩癡呆的發病進程,并命名該治療方法為“嗅三針”療法[8-9]。

“嗅三針”由兩側迎香、印堂組成,印堂在鼻根部,迎香在鼻翼兩側,二穴均能治療鼻部疾病?！鹅`樞·脈度》:“肺氣通于鼻,肺和則鼻能知臭香矣?！薄夺t林改錯·腦髓說》曰:“靈機記性在腦者,因飲食生氣血,長肌肉,精汁之清者化而為髓,由脊骨上行。入腦,名曰腦髓……鼻通于腦,所聞香臭歸于腦。腦受風熱,腦汁從鼻流出,涕濁氣臭,名曰腦漏……鼻微知香臭”[10]。《本草綱目·辛夷條》有云:“鼻氣通于天。天者,頭也、肺也?！庇纱丝梢钥闯?古人對于鼻和腦部結構功能的認識和理解,腦功能的正常與否,能夠影響鼻識別香臭之氣。同時,鼻能將所接觸的信息感知、感傳于腦,鼻與腦的這種特殊關系,為從嗅覺治療腦部疾病提供一定理論依據。

運用嗅三針治療癡呆早期出現的嗅覺功能減退,或是嗅覺障礙,發現其對癡呆出現的認知障礙也有較好改善作用[11-12]。迎香屬手陽明大腸經與足陽明胃經交會穴,刺之可宣通陽明而達到開鼻竅之功。印堂為督脈穴,《素問》曰:“督脈者……上額交顛上,入絡腦”。督脈為“陽脈之?！?連接腦之陽、全身之陽,刺之可調理督脈而達到醒腦之效。嗅三針既能治療鼻部嗅覺功能障礙,又對認知障礙有改善作用。因此,將該針法凝煉為“感知一體,嗅腦同治”,總結其機制為“通督宣陽,開竅醒神”,二穴功能主治與嗅覺系統密切相關,形成嗅三針的理論依據[13-15]。

慢性低灌注導致的腦組織損傷是VD發病的主要病因,腦在低灌注缺血缺氧過程中,氧化應激反應是其最早出現的核心事件之一[16-17]。腦缺血缺氧時產生的毒性物質,對細胞膜、細胞器均產生破壞作用,增加了氧化應激反應程度,誘導線粒體穩態失衡,最終引起海馬神經細胞壞死、凋亡,引起學習、辨識、記憶等認知功能障礙[18-19]。氧化應激與VD發病過程密切相關,Keap1/Nrf2/ARE信號通路的激活,活化Nrf2積聚游離入核,啟動抗氧化反應,調節下游抗氧化酶基因轉錄和表達,調控氧化應激反應,介導腦內神經細胞保護作用[19]。Nrf2能夠調動下游HO-1、NQO1等抗氧化酶活性,促進多種抗氧化還原酶表達,實現抗氧化應激反應[20]。本研究中,嗅三針改善了VD大鼠海馬CA1區病理組織形態,而運用Nrf2抑制劑后,該作用明顯減弱,與模型組比較,嗅三針明顯提高了Nrf2表達量,其下游HO-1、NQO1蛋白表達明顯增多,Nrf2抑制劑組Nrf2的陽性細胞率減少,其下游HO-1、NQO1蛋白表達明顯減少?？梢?Nrf2的激活在嗅三針治療中發揮著重要作用。

綜上所述,治療VD早期出現嗅覺障礙的嗅三針能夠改善大鼠認知功能障礙,通過激活Nrf2,調節下游HO-1、NQO1等蛋白表達,對抗VD大鼠出現的氧化應激,改善其認知功能狀態,這可能是嗅三針治療VD的重要機制。