黃連-肉桂配比對慢性心力衰竭大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響

何 霞,卿媛媛,常嘉昱,鐘思凡,朱筱婧,張 婷,莊 紅,顏 旭

(1.湖南中醫藥大學研究生院,湖南 長沙 410208;2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院,湖南 長沙 410006)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)是心臟結構或功能異常導致射血功能下降,無法將靜脈回流的血液排出心臟,動脈血液供應不足的疾病[1]。CHF是以呼吸困難、機體活動受限、液體滯留為特征的臨床綜合征[2]。下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸是神經內分泌系統的重要組成部分,參與調控機體應激及全身多個系統[3-4]。HPA軸失常可引起焦慮、抑郁、失眠、阿爾茨海默病、腸應激綜合征等[5-8]。心衰患者體內HPA軸呈慢性持續性激活狀態,隨著病情進展,體內腎上腺皮質酮(Corticosterone,CORT)的峰值升高,其分泌主要由垂體產生的促腎上腺皮質激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)調節,而促腎上腺皮質激素釋放激素(Corticotropin-releasing hormone,CRH)能夠增加ACTH分泌。胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)是CHF發病機制之一,當 IR 合并心力衰竭時,心肌葡萄糖代謝減少,心功能受損,因此改善IR與心功能并舉至關重要[9]。當IR時氧化依賴葡萄糖轉運蛋白4(Glucose transporter 4,GLUT4)表達量下降,引起心肌能量代謝異常,導致心衰發生[10-11]。交泰丸由黃連、肉桂按質量比10∶1組成的經典方藥。以往研究顯示,黃連-肉桂配伍可調控、改善IR,本課題組以黃連-肉桂為基礎組方的強心安神方經實驗觀察可調控多種通路,改善心衰[12-15]。本次研究通過檢測HPA 軸的激素水平及心肌 GLUT4 蛋白表達,觀察黃連-肉桂不同配比對CHF大鼠作用,闡明其改善心衰大鼠心功能的作用機制,為治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:SD 健康雄性大鼠60只,清潔SPF 級,體重 200～280 g,于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司采購[批號SCXK(湘) 2019-0004],實驗許可證號[SYXK(贛)2020-0001]。

1.1.2 主要藥物與試劑:中藥飲片黃連、肉桂均購于湖南省中醫藥研究院附屬醫院。鹽酸阿霉素注射液(批號S17092);大鼠NT-proBNP、CORT、CRH、ACTH試劑盒(批號MM-0329R1、MM-0559R1、MM-0520R1、MM-0565R1);GADPH內參一抗(批號HC201);GLUT4一抗(批號AF5386);RIPA細胞裂解液(批號C1053);BCA蛋白定量試劑盒(批號E-BC-K318-M);十二烷基硫酸鈉(批號151-21-3);甘氨酸(批號G8200)。

1.1.3 實驗儀器:移液槍(型號5-50μl)、全自動酶標儀(型號WD-2012B)、電熱恒溫培養箱(型號DHP-9082B)、高速冷凍離心機(型號TGL-16.5M)、組織脫水機(型號KD-TS3S1)、包埋機(型號HistoCore Arcadia)、切片機(型號HistoCore BIOCUT)、蛋白垂直電泳儀(型號DYY-6C)、超高靈敏度化學發光成像系統(型號Chemi Doc TMXRS+)、全自動化學發光圖像分析系統(型號Tanon-5200)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組、造模與模型鑒定:在SD雄性大鼠60只中,隨機取6只作為空白組,余54只造模處理。造模期間大鼠死亡14只,且4只精神欠佳亦舍去,剩余36只大鼠在灌胃期間死亡12只。最終各組均6只分成模型組、黃連組(黃連15 g、肉桂1.5 g)、肉桂組(黃連1.5 g、肉桂15 g)、黃連-肉桂組(黃連、肉桂各6 g)。除正常組6只大鼠外,其余組均腹腔注射1 mg/ml鹽酸阿霉素溶液,按1.25 mg/kg劑量腹腔注射,正常組注射等量0.9%氯化鈉溶液,每周2次,總共注射7次,總量8.75 mg/kg。觀察大鼠精神狀態、活動情況、飲食、體重、呼吸頻率等日常生活習慣情況,采用酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測大鼠血清N端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP),應用心臟彩超檢測心功能,通過上述方法判斷慢性心力衰竭大鼠造模情況。

1.2.2 干預方法與取材:按照上述分組進行藥物處理,按比例配伍飲片。將29.7 mg/kg的飲片煎熬濃縮成等體積容量灌胃,空白組、模型組予同體積滅菌蒸餾水灌胃,各組灌胃1次/d,持續4周。于末次給藥第2日早上取材,水合氯醛麻醉,后腹主動脈采血5 ml以上,離心,取上清,放冰箱備用;剪開肋骨,暴露胸腔,剪斷血管,剝離心臟,用0.9%氯化鈉溶液洗去殘留血液,分離心尖、左心室。ELISA法檢測血清ACTH、CORT、CRH水平;Western blotting法檢測心肌GLUT4蛋白。

1.2.3 心臟彩超檢測大鼠心功能:大鼠麻醉后應用小動物超聲系統檢測左室射血分數(Left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室軸縮短率(Left ventricular fraction shortening,LVFS)。

1.2.4 HE染色檢測心肌組織形態:大鼠腹主動脈取血后迅速解剖心臟組織,洗去殘留血液,切取心尖組織,放置于4%多聚甲醛固定48 h,石蠟包埋,切片、烤片,蘇木素水溶液染色5 min,流水沖洗15 min,梯度乙醇各脫水10 min;伊紅染色1～2 min,乙醇脫水,將玻片置于二甲苯中透明2次,3 min/次,中性樹膠封片,放入65 ℃烘箱15 min,光學顯微鏡下觀察組織形態。

1.2.5 ELISA 法檢測大鼠血清NT-proBNP、ACTH、CORT、CRH水平:大鼠麻醉后腹主動脈采血5 ml,3000 r/min離心,15 min后,保留上清液,運用 ELISA 法測定各組蛋白含量,嚴格按說明書操作。

1.2.6 Western blotting法檢測大鼠心肌組織GLUT4蛋白表達:取大鼠心肌組織,提取總蛋白,凝膠電泳分離蛋白后使用BCA法測定蛋白濃度,半干式轉法將蛋白轉移至PVDF膜上,封閉后加一抗稀釋液,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,5 min/次;二抗稀釋,室溫孵育,TBST洗膜3次,5 min/次,配制ECL發光液進行顯色檢測,Image J軟件讀取灰度值。

2 結 果

2.1 造模后各組大鼠狀態比較 空白組大鼠精神狀態良好,體重處于正常范圍,正常活動,呼吸脈搏次數無明顯變化,進食正常,二便正常。模型組、肉桂組和黃連-肉桂組大鼠精神狀態差,存在腹水,毛色干枯變黃,活動明顯減少,呼吸脈搏頻率增快,二便減少。黃連組大鼠精神一般,不喜活動,身體蜷縮,進食較少,二便稍減。

2.2 各組大鼠LVEF、LVFS、NT-proBNP水平比較 見表1。與空白組比較,模型組、黃連組、肉桂組、黃連-肉桂組的LVEF、LVFS 均低,差異有統計學意義(P<0.01)。藥物干預后,黃連-肉桂組NT-proBNP 值低于模型組,差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠LVEF、LVFS、NT-proBNP蛋白比較

2.3 各組大鼠心肌組織病理形態比較 見圖1。空白組心肌細胞形態排列致密,細胞結構完整,無明顯炎性浸潤現象。模型組心肌組織結構重度異常,心肌細胞廣泛排列紊亂,細胞輪廓不清晰,間隙增大,可見部分細胞空泡變性,如黑色箭頭所示。黃連-肉桂組、肉桂組心肌組織結構中度異常,部分區域心肌細胞排列紊亂,間隙增大,細胞輪廓不清晰,可見空泡變性,如紅色箭頭所示;間質可見少量纖維組織增生,如黃色箭頭所示;炎癥細胞浸潤,如黑色箭頭所示。黃連組心肌組織結構基本正常,細胞排列較為緊密,偶見細胞水腫,胞漿疏松空泡化,如黑色箭頭所示;組織未見明顯炎癥細胞浸潤。

圖1 各組大鼠心肌病理形態比較(HE染色,×400)

2.4 各組大鼠CRH、ACTH、CORT蛋白表達比較 見表2。給藥結束后,模型組心衰大鼠 CRH、ACTH、CORT表達均高于空白組,差異有統計學意義(P<0.05)。黃連組、肉桂組、黃連-肉桂組大鼠ACTH、CORT表達均低于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠CRH、ACTH、CORT蛋白表達比較(ng/ml)

2.5 各組大鼠心肌組織中GLUT4蛋白表達比較 見表3(圖2)。給藥結束后,模型組心衰大鼠 GLUT4蛋白表達低于空白組,差異有統計學意義(P<0.01)。黃連組、肉桂組、黃連-肉桂組大鼠GLUT4蛋白表達均高于模型組,差異有統計學意義(P<0.01)。

圖2 各組大鼠心肌組織GLUT4蛋白表達電泳圖

表3 各組大鼠心肌組織中GLUT4蛋白表達比較

3 討 論

中醫學對“心衰”的最早描述是西晉醫家王叔和的《脈經》:“心衰則伏,肝微則沉,故令脈伏而沉”[16]。歷代醫家根據心衰癥狀診斷為“心水”“痰飲”“喘證”“水腫”等[17]。中醫藥可緩解心衰癥狀、改善心功能、預后。本課題組在多年臨床實踐中發現,心衰病位在心、腎,心主血,腎主水,心火推動血脈運行,腎主全身水液代謝,心衰時心火亢盛,邪氣亢進,腎水難以制約心火,心腎水火失調,故從心腎水火相關性論治心衰。《韓氏醫通》中記載:“黃連為君,佐官桂少許,煎百沸,入蜜,空心服,能使心腎交于頃刻”是黃連-肉桂最經典配伍的出處,此配比為交泰丸,是“交通心腎”“水火共濟”治法的代表方。本課題組前期臨床研究證實,以黃連、肉桂為基礎的“強心安神方”可改善心衰癥狀,調控多條通路,改善阿霉素致心衰大鼠的心功能[13-15]。

慢性心力衰竭的病理機制錯綜復雜,主要涉及氧化應激、心室重構、神經內分泌細胞因子系統的過度激活等[18]。研究表明,HPA軸與心力衰竭密切相關,心衰患者HPA軸處于慢性持續性激活狀態,隨著病情進展,體中CORT峰值進一步升高,CORT可調動血管及心臟的鹽皮質激素受體(Mineralocorticoid receptor,MR),參與其病理過程,加重心衰程度[19]。HPA軸調節異常時皮質醇分泌增多,抑制HPA軸反饋能力降低,皮質醇進一步上升,中樞信號紊亂,導致高血壓的發生[20]。HPA軸對人體調控與腎對人體調節作用一致,腎上腺皮質激素的生理功能相當于中醫腎氣或腎陽的功能。曹利華等[21]提出“腎通于腦”的現代生物學基礎可能與HPA軸調控機制相關。中醫“腎主水”理論認為,腎調控全身水液的輸送、代謝,且應四時而調節,春夏季以蒸騰氣化為核心,秋冬季以收藏為主,這與HPA 軸可能是腎陽發揮作用的物質基礎有異曲同工之妙。腎為相火,與心交濟,互為交感互藏。腎為相火,與心交濟,互為交感互藏。心陽溫煦為火主升,以降為順,居上而屬陽;腎主水藏精歸水,主靜,以升為和居下而屬陰。一陰一陽之間,腎水滋潤心陰而心火不亢,心火溫煦腎陰使腎水不寒。本研究中,黃連性苦寒,可上清亢盛之心火,使心火下交腎水;肉桂辛甘大熱,可助陽補火,引火歸元,腎陰可上濟心陽;二者合用則有瀉南補北、交通心腎之功,使心腎水火陰陽相調。本研究中黃連、肉桂按不同比例配伍,探求藥物配比對慢性心力衰竭大鼠的作用。與空白組比較,模型組大鼠ACTH、CORT、CRH含量上升,經過黃連、肉桂不同比例干預后ACTH、CORT含量下降,說明在心衰大鼠體內HPA軸處于激活狀態,且黃連、肉桂配伍可抑制HPA軸應激,且以黃連組效果最佳,而對CRH調控無影響,考慮可能是黃連、肉桂組方只調控HPA軸下游,或是CORT負反饋調控HPA軸,使CRH上調。上述研究說明,交泰丸通過干預下丘腦-垂體-腎上腺軸治療慢性心力衰竭,且黃連、肉桂抑制ACTH、CORT分泌,改善慢性心力衰竭大鼠心功能。

心肌葡萄糖的攝取和氧化依賴GLUT-4蛋白,出現IR時,激活胰島素的蛋白通路受阻,GLUT4蛋白表達或易位減少,導致心肌攝取葡萄糖減少,引起心肌能量代謝異常,心功能受損,心衰發生[22]。IR會削弱心肌代償力,激活交感神經系統,影響斑塊穩定性,破壞凝血、纖溶系統平衡,鈣信號通路異常等導致HF發生發展。因此,GLUT4蛋白表達可反映心肌胰島素抵抗狀態。本實驗中,模型組大鼠 GLUT4蛋白表達下降,說明心衰時存在胰島素抵抗;黃連、肉桂配伍干預后,大鼠GLUT4蛋白表達上升,說明其可上調GLUT4 蛋白表達,改善胰島素抵抗,且比黃連組更有效。由此可見,心力衰竭與HPA軸功能調節失衡密切相關,黃連、肉桂配伍從整體上調控HPA軸功能,抑制胰島素抵抗,改善大鼠慢性心力衰竭。

綜上所述,黃連、肉桂配伍可改善心衰大鼠癥狀,降低大鼠血清NT-proBNP水平,保護心功能,調控HPA軸,改善胰島素抵抗狀態。