益心附葶飲對慢性心力衰竭心腎陽虛證大鼠HIF-1/VEGF信號通路的影響

陳銘欽,雷瑗琳,師瑞瑞,全依晨,周納納,陳晉玉,韓 茹

(1.陜西中醫藥大學,陜西 咸陽712046;2.西安市中醫醫院心血管內科,陜西 西安 710021)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)是由于各種心臟疾病引起的心臟組織結構及功能異常,致使機體心室充盈功能低下或心室泵血不足,不能滿足機體代謝需要,器官、組織血液灌注不足,出現肺循環和(或)體循環瘀血。CHF是各器質性心臟病發展到終末期的臨床綜合征,是心血管疾病患者死亡的主要原因,且其具有發病率高、再入院率高、病死率高的特點[1]。CHF 住院率占同期心血管病的 20%,病死率占40%,隨著老齡化進程加快,CHF 發病率也呈逐年上升趨勢,已成為威脅人類生命健康的最重要心血管病[1-2]?，F代醫學治療慢性心力衰竭存在長期用藥的耐藥性問題、不良反應等,影響心臟不良事件及預后獲益。中醫學能夠分時機、分階段對患者復雜多變的證候制定相應的治療方案,并具有突出優勢。益心附葶飲是雷瑗琳主任醫師根據多年臨床經驗制定的治療CHF終末期驗方。前期臨床與實驗觀察表明,益心附葶飲對慢性心力衰竭終末期具有良好的臨床療效,機制可能與調整心肌細胞能量代謝有關,具有減少炎癥因子釋放,抑制心室重構,延緩心力衰竭發展的作用。近年研究發現,缺氧誘導因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1α)能夠促進 AS 斑塊內炎癥反應浸潤和平滑肌細胞增殖、遷移,低氧下集聚的 HIF-1 能夠激活血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受體,促進調節血管新生。諸多學者通過臨床觀察發現,慢性心力衰竭晚期主要為心腎陽虛證、水飲上泛證,在選方用藥上益氣溫陽化瘀利水法應用最為廣泛,如苓桂術甘湯、真武湯、桂枝茯苓丸等能有效改善心力衰竭心腎陽虛證患者的心功能[3-5]。多項中醫藥研究表明,益氣活血利水中藥通過影響不同信號通路延緩其發生發展[6-7]。本研究通過觀察益心附葶飲對實驗小鼠心肌組織HIF-1α蛋白表達和HIF-1/VEGF信號通路抑制作用,探討其抑制炎癥反應、減緩心肌重構機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:清潔級雄性SD大鼠60只,平均體重(200±20)g,均購自中國人民解放軍空軍軍醫大學實驗動物中心;許可證[SCXK(陜)20119-001]。飼以實驗動物專用飼料(購自西安天工生物醫藥研究所),自由進食、飲水,平均溫度(22±2)℃,平均濕度(60±5)%,光照為12 h明-暗循環,光照時段7:00～19:00,實驗期間60只大鼠均未死亡。

1.1.2 實驗試劑:羥基脲(批號C13337589,上海麥克林生化科技股份有限公司),PBS 1X(批號GA22090372609,武漢賽維爾生物科技有限公司),N端前腦鈉肽(NT-proBNP,批號22090635N,上?？婆d商貿有限公司) ,超敏C反應蛋白(批號22090641N,上?？婆d商貿有限公司),內皮素1(批號22090645N,上?？婆d商貿有限公司),白介素6(批號22090642N,上?？婆d商貿有限公司),HIF-1α mRNA引物(上游批號A058407、下游批號A058408,武漢賽維爾生物科技有限公司),HIF-1α抗體(批號bs-0737R,北京博奧森生物技術有限公司),蛋白定量試劑盒(批號BA1207,南京建成生物工程公司),PVDF膜(批號0000167004,德國Merck Millipore公司)。

1.1.3 實驗儀器:低溫離心機(型號H2050R,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司),包埋機(型號Histo Star,武漢俊杰電子有限公司),病理切片機(型號HM 340E,上海徠卡儀器有限公司),組織攤片機(型號TKY-TKA,浙江省金華市科迪儀器設備有限公司),染色機(型號ST5010),高速組織研磨儀(型號OSE-Y30,武漢賽維爾生物科技有限公司),渦旋儀(型號QL-901,海門市其林貝爾儀器制造有限公司),低速離心機(型號TD4,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司),化學發光成像分析儀(型號Mini Chemi 500,北京賽智創業科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 益心附葶飲:黑附片(先煎)、葶藶子、太子參、茯苓、丹參各30 g,白術、枳殼各15 g,川芎、桂枝各12 g,地黃24 g,砂仁9 g,以上藥物由西安市中醫醫院制劑科提供顆粒劑。

1.2.2 建模、分組及給藥:將60只雄性SD大鼠隨機分為五組,每組12只,為防止動物死亡導致樣本量不足,每組多備2只,共計70只。術前禁食8 h,將大鼠放置麻醉箱中,調整麻醉系統,異氟烷占異氟烷、氧氣混合氣體濃度4%～5%,大鼠持續吸氧3 min,麻醉后左前胸備皮后碘伏消毒、開胸,暴露心臟,在冠狀動脈起始2～3 mm處結扎左冠狀動脈前降支,關胸。術后1 d灌胃給予羥基脲300 mg/kg,1 次/d,連續14 d,建立心力衰竭心腎陽虛證模型。假手術組:只穿線,不結扎,灌胃給予0.9%氯化鈉溶液2.5 ml/kg,2次/d,4周。模型組:制備心力衰竭模型,成模后灌胃給予0.9%氯化鈉溶液2.5 ml/kg,2次/d,4周。中藥低劑量組:制備心力衰竭模型,成模后給予生藥0.25 g/ml,4周,2次/d。中藥高劑量組:制備心力衰竭模型,成模后給予生藥1 g/ml,4周,2次/d。纈沙坦組:制備心力衰竭模型,成模后灌胃給予纈沙坦1.14 mg/kg,2次/d,4周。

1.2.3 HE染色觀察心肌病理組織學變化:石蠟切片依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%乙醇5 min,自來水洗。蘇木素染色:切片入蘇木素染液染3～5 min,自來水洗,分化液分化,自來水洗,返藍液返藍,流水沖洗。伊紅染色:切片依次入85%、95%梯度乙醇脫水各5 min,入伊紅染液中染色5 min。脫水封片:切片依次放入無水乙醇Ⅰ 5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min透明,中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢并圖像采集分析。

1.2.4 qPCR檢測心肌組織HIF-1 mRNA表達:組織中加入Trizol試劑提取mRNA,加入60 μl氯仿,強力振搖15 s,靜置3 min,4 ℃、12000 r/min離心10 min,吸取水相即組織RNA提取物;加入100 μl異丙醇于水相靜置10 min,4 ℃、12000 r/min離心10 min,沉淀RNA,棄上清;加入200 μl用DEPC水配75%乙醇洗RNA,4 ℃、7500 r/min離心10 min,棄上清,干燥RNA5～10 min;加入20 μl DEPC水溶解RNA,通過RNA定量儀對其進行定量,-80 ℃凍存。使用Evo M-MLV反轉錄試劑盒進行反轉錄(Reverse transcription,RT)反應,將提取的mRNA合成為cDNA;反應條件為37 ℃、15 min,85 ℃、5 s,4 ℃。使用SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒進行聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR),采用兩步法對cDNA進行擴增,并對其進行熒光實定量,反應條件為95 ℃、30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,40個循環。引物終濃度為0.4 μmol/L,GAPDH為內參,使用2-△△Ct方法計算相對表達量,并對產物的解鏈曲線進行分析,確保反應特異性,HIF-1上游引物5’-GGCGAAGCAAAGAGTCTGAAGT-3’、下游引物5’-TAGCACCATAACAAAGCCATCC-3’。

1.2.5 Western blotting檢測心肌組織HIF-1蛋白表達:將組織用含有1%蛋白酶抑制劑的4 ℃預冷RIPA裂解緩沖液裂解,細胞裂解物在12000 r/min、4 ℃下離心10 min,收集上清液,保存待用。BCA法測定蛋白質濃度,10%的SDS-PAGE分離出等量蛋白質20 μg轉移到PVDF膜上;于室溫下用5%牛奶在TBST中封閉膜2 h,并于4 ℃與HIF-1一抗孵育過夜,再將膜與二抗于37 ℃孵育2 h;用ECL試劑盒對印跡進行可視化。

1.3 統計學方法 應用Graph Pad Prim 6.0統計學軟件對數據進行分析。計量數據以平均值±標準差表示,組間均數的綜合比較采用方差分析,組間兩兩比較采用Tukey檢驗;P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌組織形態學比較 見圖1。HE染色后觀察大鼠心肌組織形態學變化,藍色箭頭所示為纖維組織。與假手術組比較,模型組大鼠各心肌細胞間距明顯增寬,心肌纖維排列紊亂,有大量膠原纖維蛋白沉積,心臟纖維組織表達面積升高;與模型組比較,中藥組各心肌細胞間隙縮窄,排列較整齊致密,大鼠心肌組織中僅見少量膠原纖維蛋白沉積。

圖1 各組大鼠心肌組織形態學比較(HE染色,×40)

2.2 各組大鼠射血分數比較 見表1(圖2)。由超聲心動圖檢測可知,模型組射血分數低于假手術組,差異有統計學意義(P<0.05),可見造模成功。中藥低劑量組、中藥高劑量組、纈沙坦組大鼠射血分數均高于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠心功能射血分數比較(%)

圖2 各組大鼠超聲心動圖比較

2.3 各組大鼠心肌組織HIF-1α mRNA表達及蛋白水平比較 見表2(圖3)。模型組大鼠心肌組織HIF-1 mRNA及蛋白表達低于假手術組,差異有統計學意義(P<0.05),可見造模成功。中藥低劑量組、中藥高劑量組、纈沙坦組HIF-1α mRNA及蛋白表達均高于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠心肌組織HIF-1α mRNA及蛋白表達比較

圖3 各組大鼠HIF-1α蛋白電泳圖

2.4 各組大鼠血清NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6比較 見表3。模型組大鼠NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6低于假手術組,差異有統計學意義(P<0.05),可見造模成功。中藥低劑量組、中藥高劑量組、纈沙坦組大鼠血清NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6水平均低于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6水平比較

3 討 論

各種條件導致慢性缺血缺氧是心血管疾病發生的前提,對冠狀動脈疾病、心肌梗死、心力衰竭等的發生發展具有深遠意義[8]。缺氧狀態下,細胞的存活需要激活許多分子信號通路,以達到刺激血管生成、促紅細胞生成以及有利于糖酵解的代謝重組模式,這種生物反應稱為缺氧適應性反應[9]。心臟在遭受缺血損害、神經-內分泌系統調節紊亂、炎癥細胞因子等慢性刺激后機體產生適應性反應,特征性的表現為心肌纖維化、心肌肥大和心肌細胞壞死凋亡,導致心肌重量、心室容量增加及心臟功能變化,即心室重構, 而心室重構是目前公認的誘導心力衰竭發生的緊要機制,也是心功能不全的獨立危險因子,所以如何及時有效的預防和逆轉心室重構過程是改善慢性心力衰竭轉歸的關鍵所在,探索心室重構發展進程中的相關信號通路及各通路抑制劑在心室重構的機制研究和臨床應用等也顯得尤為緊要。HIF-1是由α亞基和β亞基構成的異源二聚體,α亞基編碼基因定位于第14 號染色體,為 HIF-1的活性亞基,受氧濃度變化的精確調節,是缺氧信號主要的、也是最普遍表達的調節因子。HIF-1α主要集中在心肌細胞上,HIF-1α不僅具有調節增加葡萄糖轉運蛋白和糖酵解酶的轉錄以改善葡萄糖利用率功能,還能通過抑制線粒體呼吸以減少氧的使用,建立糖酵解和氧化代謝間的平衡關系,在不增加活性氧水平的狀態下,達到腺苷三磷酸(ATP)的最高產量[10],且其在ECM重構和缺血預適應以及動脈粥樣硬化進程中的作用已被證實。在一項小鼠心肌梗死的實驗研究也證實HIF-1治療心肌梗死,可縮小心肌梗死面積,改善左室重構[11]。Li等[12]首次提出 HIF-1α對心臟的損害作用,當心臟供血明顯受限,敲除 VHL 基因會導致 HIF-1α缺氧反應通路的慢性激活,進而出現一系列的組織學改變,包含心肌細胞喪失和心肌纖維化等,最終導致心力衰竭加重。目前,學者普遍認為,HIF 激活在輕度缺氧時對心肌具有保護作用,但在慢性、重度缺氧狀態等終末心力衰竭中對心肌有損害作用。Hoscher等[13]也發現在心肌病晚期心力衰竭患者中,HIF-1α的表達增加并處于持續激活狀態。血管內皮細胞缺氧,又是加速動脈粥樣硬化(AS)進程的重要影響因素。另一項研究顯示,HIF-1α能夠促進 AS 斑塊內炎癥反應浸潤和平滑肌細胞增殖、遷移,低氧下積聚的HIF-1能夠激活血管內皮生長因子(VEGF)和 VEGF 受體,促進調節血管新生。白楊等[14]通過建立新生大鼠原代心肌細胞培養模型,證明抑制 HIF-1α表達可能是辛伐他汀心肌保護作用的機制之一,這種保護機制可能與辛伐他汀減少缺血/再灌注損傷后的心肌細胞凋亡有關。以上研究顯示HIF-1α的雙向表達特征,即輕度缺氧時對心肌具有保護作用,但同時發現在慢性、重度缺氧狀態等終末心力衰竭中對心肌有損害作用。

“心力衰竭”屬于中醫心力衰竭病,曾按照“喘證”“胸痹”“水腫”“肺脹”等辨治?！端貑枴ゐ粽摗酚涊d:“心主身之血脈”,《素問·五臟生成篇》亦云:“諸血者, 皆屬于心。”二者皆提示血脈的正常運行是心的功能,若心之氣、陽虛衰,則血脈鼓動無力,血行不暢,進而留而為瘀?！端貑枴つ嬲{論篇》:“若心氣虛衰,可見喘息持續不已。”《素問·臟氣法時論》說:“心病者,日中慧,夜半甚,平旦靜”[15]。可見血脈正常運行有賴于心氣與心陽的推動。國醫大師鄧鐵濤[16]提出:心力衰竭就是因為心陽氣虛衰,功能不全,血脈運行不暢,以致臟腑經脈失養,功能失調,治療主張陰陽分治溫補為上,對心力衰竭終末期辨治意義重大。雷主任總結多年治療慢性心力衰竭經驗,提出心氣、心陽是心主血脈功能正常發揮的動力之源[17-18]。“血不利則為水”,瘀血留滯可化水為飲,水飲為有形實邪,易阻無形之氣的運行,因“氣為血之帥”,氣行則血行,氣滯則血瘀,水飲進一步加重血瘀,水飲與血瘀互為因果,互為影響。心力衰竭的病機虛實夾雜,表現在虛、瘀、水三端,三者又互為因果,其中心氣虛、陽虛是內因,是病理基礎;貫穿于心力衰竭發生與發展始終,影響著CHF的預后,病機關鍵點為心氣心陽虛衰;痰濁、水飲和血瘀是主要病理產物[19]。故陽衰陰竭,水瘀互結是終末期心力衰竭的主要證候,助陽利水化飲通絡是中醫治療基礎。“益心附葶飲” 在原真武湯基礎上創制,附子、葶藶子為君藥,輔助利水化瘀中藥,有助陽益陰、利水通絡的功效,臨床應用多年,能快速緩解臨床癥狀,大大減少再次住院頻次,具有良好的社會和經濟效益。附子中的烏頭堿會抑制心肌衰弱,起到保護心肌的作用[20]。葶藶子及其有效成分不僅能增加心肌細胞收縮能力,增加冠脈血流量,還具有顯著抗臟器纖維化作用[21]。前期研究顯示,益心附葶飲通過下調Collagen1、Collagen3蛋白表達和抑制NF-κB P65信號通路介導的炎癥反應,抑制壓力性心力衰竭大鼠心肌纖維化[22]。同時可抑制壓力性心力衰竭大鼠心肌纖維化和心室重構,其作用機制可能與抑制TGF-β/Smad信號通路過度激活有關。

本實驗研究證實,益心附葶飲特別在高劑量時,能有效提高心力衰竭小鼠射血分數,改善血流動力學, 同時抑制炎癥因子,降低心肌纖維組織表達面積,降低心肌組織中HIF蛋白表達含量,抑制其異常過量沉積,發揮治療心肌纖維化作用,對CHF終末期精準治療有積極的指導意義。

綜上,益心附葶飲可能是通過下調HIF-1α蛋白表達和抑制HIF-1/VEGF信號通路介導的抑制炎癥反應,降低心力衰竭大鼠血清NT-proBNP、hs-CRP、ET-1、IL-6表達從而減緩心力衰竭大鼠心室重構進程。