當歸芍藥散對血管性癡呆大鼠炎癥因子及神經細胞凋亡的影響

姜 林,李 彬,臧運華,于 淼,王 群,周喜燕

(1.山東中醫藥大學,山東 濟南 250355;2.青島大學附屬海慈醫院,山東 青島 266033)

血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)是一種神經認知障礙,是由于流向大腦的血流減少或缺乏而導致記憶、認知功能惡化,是年齡相關性認知障礙的第二大常見病因,占所有癡呆病例20%,僅次于阿爾茨海默病[1]。據世界衛生組織統計,每年新發癡呆患者35萬以上,預計6年后將增加1倍[2]。血管性癡呆目前發病機制尚不明確且沒有特效治療方法,因此探索VaD發病機制對防治VaD具有重要意義。

當歸芍藥散出自張仲景所著《金匱要略》,由當歸、白芍、川芎、白術、澤瀉、茯苓組成,具有養血和血、活血化瘀功效,原文為治療妊娠、產后腹痛。20世紀80年代日本學者水島宣昭首次應用當歸芍藥散治療癡呆,發現能明顯減輕患者攝食、運動、智能障礙等[3]。現代研究指出,當歸芍藥散具有抗炎、抗氧化活性,能抑制腎上腺素能神經系統功能,改善中樞膽堿能神經系統功能障礙,減少海馬細胞凋亡,緩解認知功能障礙[4]。因此,本研究以血管性癡呆大鼠為研究對象,基于炎癥反應、神經細胞凋亡探討當歸芍藥散對血管性癡呆的治療作用,為疾病恢復提供新方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:純種SPF級SD雄性大鼠30只,平均體重(200±20)g,由青島市實驗動物中心提供。在安靜環境下分籠飼養,平均室溫(23±1)℃,相對濕度60%,光線自動控制,明(7:00～19:00)、暗(19:00～7:00)交替,統一用顆粒型普通大鼠飼料喂養,自由飲用涼開水。自由攝食條件下適應性喂養1周。

1.1.2 實驗藥物:當歸芍藥散由當歸、白芍、川芎、茯苓、澤瀉、白術組成,所有藥品均購自青島市中醫院中藥房,藥品均為道地藥材。尼莫地平片(規格20 mg/片,批號H20003010)。

1.1.3 實驗試劑:二甲苯、無水乙醇、碳酸鋰、冰醋酸、30%H2O2(批號10023418、10009218、20022818、10000218、10011218,國藥集團化學試劑有限公司);蘇木素(批號G1004,Servicebio公司);Bax兔抗(1∶1000,批號PAB46088);Bcl-2兔抗(1∶1000,批號A00040-1,博士德公司);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6) ELISA試劑盒(批號QYH-12018);蛋白質Marker(批號P12103,Helix公司);PVDF轉移膜、化學發光試劑(批號IPVH00010、WBKLS0500)。

1.1.4 實驗儀器:正置顯微鏡、石蠟切片機(型號DM1000、RM2235,徠卡纖維系統有限公司);移液器(型號P100、P200,吉爾森P型移液器公司);恒溫烘箱(型號DHG-9023A,上海一恒科學儀器有限公司);攤片烤片機、自動組織脫水機(型號TKD-TK、TKD-TSF,湖北康強醫療器械有限公司);生物組織包埋機-冷凍機(型號TB-718L,泰維科技公司);電泳儀(型號mini protean 3 cell);水迷宮(型號zs-Morris);水浴鍋(型號HI1210);全自動化學發光儀(型號Tanon-5200);UPT優普特實驗室超純水器(型號ULUPURE)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及造模:大鼠適應性喂養1周后采用隨機數字表法分為假手術組、模型組、當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組,各組6只。采用雙側頸總動脈永久性結扎法建立血管性癡呆模型大鼠[5]。大鼠造模前禁食12 h,用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉,仰臥固定于手術板上備皮消毒,分離雙側頸總動脈結扎,縫合切口。假手術組大鼠不結扎頸總動脈,只做皮膚切口和組織分離處理后縫合皮膚。手術后所有大鼠均應用青霉素10萬單位肌注3 d預防感染。

1.2.2 給藥方法:當歸9 g,白芍48 g,川芎、澤瀉各24 g,茯苓、白術各12 g,超純水浸泡1 h后,煮沸,收集藥液,再用6倍體積超純水煮沸,收集藥液,混合2次藥液,60 ℃濃縮,分裝置于-20 ℃冰箱保存,使用前加熱稀釋至所需濃度。各治療組于造模完成1周后開始灌胃給藥,當歸芍藥散低劑量組灌胃當歸芍藥湯1.8 g/kg;當歸芍藥散高劑量組灌胃當歸芍藥湯7.2 g/kg;尼莫地平組灌胃尼莫地平片20 mg/kg;假手術組、模型組灌胃等體積蒸餾水。各組大鼠均1次/d給藥,持續4周。

1.2.3 Morris水迷宮測評實驗:大鼠灌胃第4周,各組大鼠隨機選取3只進行Morris水迷宮實驗。定位航行實驗測量大鼠學習能力,將水池分為4個象限,將各組大鼠按象限順序依次面向池壁放入水中,記錄90 s內成功爬上平臺所需要時間,設定大鼠找到平臺并滯留5 s及以上為成功,即逃避潛伏期。當大鼠超過90 s仍未找到平臺時,則引導其至平臺位置,并使其在平臺上停留20 s后放回籠中,此類大鼠逃避潛伏期記90 s。每只大鼠每天訓練4次,早晚各2次,每次不同象限測定時間間隔為1 h,連續4 d。第5天進行測試,取4個象限逃避潛伏期時間的均值作為學習成績檢測指標。定位航行測試完成后第2天,撤除實驗平臺,測試大鼠90 s進入穿越平臺的次數。空間探索實驗測量大鼠記憶能力。

1.2.4 標本采集及檢測:術后30 d,提取Morris水迷宮后3只大鼠,1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉,腹主動脈取血,3000 r/min離心10 min,取上層血清,于-20 ℃中保存備用。開顱,取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分即海馬腦組織,用4%多聚甲醛固定備用。

1.2.5 腦組織病理:取出海馬組織,石蠟包埋,做冠狀切片,片厚3 μm,置于Eppendorf管中,-80 ℃保存。按照試劑盒使用說明進行HE染色。光鏡下采用 Leica Application Suite圖像采集樣本相關位置,觀察海馬各區組織細胞學改變,評價神經元損傷程度及范圍。

1.2.6 Western blotting檢測海馬組織Bcl-2、Bax蛋白表達:取出海馬組織,提取總蛋白,BCA法進行蛋白濃度定量,對各組大鼠海馬組織上述蛋白水平進行檢測,以GAPDH為內參,進行蛋白條帶灰度值數據分析。

1.2.7 免疫組化法檢測海馬組織Bc1-2、Bax蛋白表達:取出腦組織,切片用SP法染色,嚴格按照試劑盒說明進行。目標蛋白為棕黃色或棕褐色顆粒,光鏡下每張片子隨機選取3個視野,采用Image J軟件進行平均光密度分析反映免疫組化的蛋白表達強度。

1.2.8 ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β含量:取出血清,按照ELISA試劑盒說明書操作,在多功能酶標儀450 nm波長處讀取數值并進行分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮測評比較 見表1。模型組較假手術組大鼠逃避潛伏期時間延長;當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組較模型組逃避潛伏期縮短,差異有統計學意義(P<0.01)。當歸芍藥散低劑量組與模型組逃避潛伏期比較,差異無統計學意義(P>0.05)。模型組大鼠穿越平臺次數少于假手術組,當歸芍藥散低劑量、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組穿越平臺次數多于模型組,差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠Morris水迷宮測評實驗比較

2.2 各組大鼠腦組織病理形態比較 見圖1。假手術組大鼠海馬神經細胞形態完整,排列緊密;模型組大鼠海馬神經元呈現結構疏散、排列紊亂、胞核固縮、邊界不清等病理學變化;當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組大鼠海馬神經元改變均減輕,且當歸芍藥散高劑量組細胞層變厚,結構清晰,細胞核固縮減輕最明顯。

圖1 各組大鼠海馬神經元形態比較(HE染色,×200)

2.3 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax蛋白表達比較 見表2(圖2)。模型組較假手術組海馬組織Bcl-2蛋白表達下降,當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組海馬組織Bcl-2蛋白表達高于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)。模型組較假手術組Bax蛋白表達增多,當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組Bax蛋白表達均低于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)。

A:假手術組;B:模型組;C:當歸芍藥散低劑量組;D:當歸芍藥散高劑量組;E:尼莫地平組

表2 各組大鼠海馬組織Bc1-2、Bax蛋白表達比較

2.4 各組大鼠免疫組化海馬組織Bc1-2、Bax表達比較 見表3(圖3)。模型組海馬組織Bcl-2平均光密度低于假手術組,差異有統計學意義(P<0.01)。當歸芍藥散高劑量組海馬組織Bcl-2平均光密度高于模型組,差異有統計學意義(P<0.01)。當歸芍藥散低劑量組、尼莫地平組海馬組織Bcl-2平均光密度與模型組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。假手術組Bax平均光密度值高于模型組,當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組Bax平均光密度值低于模型組,差異有統計學意義(P<0.01)。

表3 各組大鼠海馬組織Bc1-2、Bax光密度值比較(au)

2.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量比較 見表4。模型組血清TNF-α含量高于假手術組,當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組TNF-α含量低于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)。模型組血清IL-1β高于假手術組,當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組IL-1β含量低于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量比較(pg/ml)

3 討 論

血管性癡呆在中醫學歸為“癡呆”“呆病”范疇。《臨證指南醫案》中記載“中風初起,神呆遺尿,老人厥中顯然。”《雜病源流犀燭·中風》中記載“中風后善忘”[3],可見古代就出現了血管性癡呆的病癥,臨床表現為記憶力減退、呆傻愚笨等。關于癡呆的病因病機,主要是脾氣虧虛為本,痰瘀阻絡為標,以虛和瘀為主要病理因素,導致髓海不足,腦神失養[6]。當歸芍藥散中,芍藥養血調經,柔肝止痛,歸肝、脾經,為君藥;川芎行氣止痛,歸肝、膽、心包經,為臣藥;澤瀉滲利濕濁,歸腎、膀胱經,與川芎二者共為臣藥;當歸補血活血,歸肝、心、脾經,助川芎行氣化瘀、助芍藥養血柔肝;茯苓、白術健脾燥濕,與當歸同為佐藥;和酒服用,可助血行,酒為使藥。氣血兼顧,養血行滯,痰瘀同治,寓攻于補[7]。李世英等[8]發現,當歸芍藥散可調節腦海馬神經肽CGRP、ET-1、SS含量,改善血管性癡呆小鼠學習記憶能力。Itoh等[9]研究發現,當歸芍藥散改善了中樞膽堿能神經系統功能障礙和東莨菪堿誘導的小鼠大腦Ach水平降低,是治療癡呆的有用方劑。Huang等[10]研究發現,當歸芍藥散通過改善APP/PS1小鼠氧化應激和炎癥,改善認知缺陷。Lu[11]研究發現,當歸芍藥散能夠改善大鼠學習缺失,此作用與提高體內超氧化物歧化酶有關。鄭素霞等[12]研究發現,當歸芍藥散通過調節大腦海馬自由基代謝,改善血管性癡呆小鼠學習與記憶能力。

神經炎癥是癡呆神經變性的一個重要過程,涉及淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經元損傷、纏結形成和死亡的惡性循環。有證據表明,Aβ誘導的神經炎癥與高水平促炎細胞因子有關,包括TNF-α、IL-6、IL-1β[13]。當腦損傷發生后,炎癥因子聚集,激活APP切割酶β分泌酶來促進Aβ產生,誘導促炎細胞因子增加,加重炎癥損傷,促進神經細胞凋亡[14]。此外,炎癥反應還可通過級聯反應,破壞血腦屏障,加重認知功能損傷[15]。潘艷芳等[16]研究發現,當歸芍藥散可抑制小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6表達,緩解小鼠認知功能障礙。宋禎彥等[17]研究發現,當歸芍藥散組大鼠炎癥因子IL-1β和IL-18 mRNA表達顯著降低,可抑制神經炎癥反應,保護神經。姚麗偉[18]研究發現,當歸芍藥散活性成分可調節小膠質細胞M1/M2表型穩態,減輕炎癥反應,阻滯細胞自噬,抑制細胞凋亡。

神經細胞凋亡指在某些生理和病理因素共同作用下激活細胞膜信號傳導系統,促使相關凋亡調控因子啟動,造成神經細胞死亡。神經細胞對血管性癡呆凋亡途徑主要包括線粒體、Caspase家族、死亡受體、內質網應激等介導。內在凋亡途徑主要依靠Bcl-2家族蛋白對線粒體外膜通透性調節。線粒體介導的凋亡通路主要與Bcl-2、Bax有關,Bcl-2是抑制細胞凋亡的調控蛋白,Bax是促進細胞凋亡的調控蛋白。線粒體途徑在細胞內觸發,激活Bax在線粒體外膜中形成孔,釋放細胞色素C,降解細胞蛋白。正常情況下,Bcl-2和Bax保持平衡[19]。

海馬是機體學習及記憶的高級神經中樞,當海馬神經元處于應激狀態,凋亡途徑被激活,誘導Bcl-2等凋亡蛋白,促使海馬神經細胞死亡,機體學習及記憶功能受損,產生認知功能減退[20]。李澤等[21]研究發現,當歸芍藥散組大鼠可增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達,其機制是通過Bcl-2信號通路,改善Aβ誘導的膽堿能神經元凋亡。楊苗等[22]研究發現,當歸芍藥散組大鼠神經元凋亡率顯著降低,Bcl-2/Bax比值升高,促進線粒體自噬,改善線粒體功能,發揮神經保護作用,因此抑制神經細胞凋亡可以起到預防VaD作用。

本實驗表明,模型組大鼠較假手術組大鼠病理學形態紊亂,Bax、TNF-α、IL-1β含量明顯增加,Bcl-2含量明顯減少,逃避潛伏期時間延長,穿越平臺次數減少,說明在VaD發病時,機體炎癥反應、神經細胞凋亡被激活。當歸芍藥散各劑量組、尼莫地平組較模型組病理學形態呈不同程度改善,Bax、TNF-α、IL-1β含量減少,Bcl-2含量增加,逃避潛伏期明顯縮短、穿越平臺次數明顯增加,其中當歸芍藥散高劑量組改善最顯著,說明高劑量當歸芍藥散可明顯降低血管性癡呆大鼠炎癥因子神經細胞凋亡。