宜昌莢蒾葉片誘導愈傷組織及植株再生體系的建立

孫曉慧，呂洪巖，孫 超，于曉明，宋 黎，徐 濤，董愛新，陳甘牛*

（1.煙臺市森林資源監測保護服務中心，山東 煙臺 264001；2.東阿縣林業發展中心，山東 聊城252299;3.山東省林業科學研究院，山東濟南 250014）

宜昌莢蒾（Viburnum erosum Thunb.）是忍冬科莢蒾屬植物，落葉灌木，在我國華東、華中、西南及陜西、廣東、廣西均有分布。多生于海拔600—700 m 的山坡林下或灌叢中，枝葉稠密，樹冠球形，葉色果色獨特。不僅具有較高的觀賞價值，還具有很高的藥用價值，在園藝觀賞及藥用等方面都具有很高的開發利用價值[1]。

目前，莢蒾屬的繁育方式主要有播種、扦插等[2]。宜昌莢蒾種子小，打破種子休眠所需外部條件苛刻。扦插極不易生根成活，且野生種質資源有限。宜昌莢蒾的繁育極困難，現有的繁育方式難以滿足市場的需要，極大阻礙了宜昌莢蒾野生種質資源的保護和開發利用[3-4]。植物組織培養技術具有繁殖系數高、不受季節限制、保持無性系優良特性等優點，是在短期內解決宜昌莢蒾規模化繁育技術難題的有效手段[5]。近年來，莢蒾屬植物的組培研究倍受關注，其中雞樹條莢蒾、歐洲莢蒾、地中海莢蒾、香莢蒾等均已進行組培研究獲得了再生植株[6-10]，但宜昌莢蒾組織培養方面的研究報道比較少。宜昌莢蒾組培快繁主要存在脫分化難以發生、增殖擴繁難以突破、無根苗難以生根的難題。本研究以宜昌莢蒾葉片為外植體，從培養基種類、植物生長調節劑配方等方面，對宜昌莢蒾愈傷組織的誘導、再分化、增殖、生根進行探討，建立了宜昌莢蒾植株再生體系，為種質資源保護和工廠化育苗提供技術支撐[11]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗時間為2022 年4 月26 日，試驗材料采自山東省煙臺市萊山區曲村試驗基地多年生宜昌莢蒾植株，剪取當年生顏色淡綠、無病蟲害嫩葉為外植體，帶回實驗室備用。

1.2 方法

1.2.1 無菌體系的建立

選取宜昌莢蒾幼葉，用水沖洗后，再用洗衣粉浸泡15 min，浸泡期間用軟毛刷輕柔刷洗，再用流水沖洗4 h，無菌水沖洗1～2 次，移入超凈工作臺進行外植體消毒處理。采用75%乙醇和0.1%升汞(HgCl2)溶液組合進行消毒處理。用75%的酒精浸泡30 s 后，無菌水沖洗2～3 次，用0.1%的升汞處理5～6 min，用無菌水沖洗4～5次。在培養皿中將葉片剪為0.5 cm×0.5 cm 大小的方塊作為外植體，葉背面朝下，接種在誘導培養基上。

1.2.2 宜昌莢蒾愈傷組織的誘導

以MS、1/2MS、N6 為基本培養基，添加6-BA 和NAA 兩種植物生長調節劑，6-BA 的質量濃度為0.05、0.07、0.09 mg·L-1，NAA 質量濃度分別為0.5、0.75、1.0 mg·L-1。按照正交設計L9(34)，采用3 因素3 水平，共9個處理。每個處理接種15 瓶，每瓶3 塊葉片，重復3 次。培養基中均添加30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂，pH 值為5.8。培養條件為溫度25±2℃，濕度75%，光照強度為1800lx，光處理時長為8 h/d，暗處理時長為16 h/d。恒溫生化培養箱中培養15 天，統計愈傷組織誘導率，并記錄愈傷組織的生長狀態。

1.2.3 宜昌莢蒾愈傷組織的再分化

切取質地較好、顏色淡黃的胚性愈傷組織，以1.2.2 中得到的最適宜培養基為基本培養基，添加6-BA、TDZ、IBA、IAA4 種植物生長調節劑，6-BA 的質量濃度為0.5、0.75、1.0 mg·L-1，TDZ 質量濃度分別為0.1、0.3、0.7 mg·L-1，IBA 質量濃度分別為0.1、0.25、0.5 mg·L-1，IAA 質量濃度分別為0.05、0.1、0.2 mg·L-1。按照正交設計L9(34)，采用4 因素3 水平，共9 個處理。每個處理接種20 瓶，每瓶接種4 塊愈傷組織。每個試驗處理重復3 次。培養基中均添加20 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂，pH 值為5.8。培養條件為溫度25±2℃，濕度75%，光照強度為1800 lx，光暗處理時長各為12 h/d。置于恒溫生化培養箱中培養，密切觀察并記錄愈傷組織的分化狀態，15 天后統計再分化率。

1.2.4 不定芽增殖擴繁

從愈傷組織上剪取不定芽進行增殖培養，培養基和培養環境與1.2.3 相同。觀察并記錄不定芽增殖擴繁情況，10 天后統計增殖系數。

1.2.5 生根培養

當不定芽高度生長至3～4 cm、葉片4～5 片時，轉接到生根培養基上進行生根培養。以添加6-BA、NAA、IBA 植物生長調節劑，6-BA 的質量濃度為0、0.05、0.1 mg·L-1，NAA 質量濃度分別為0、0.3、0.5 mg·L-1，IBA質量濃度分別為0、0.3、0.5 mg·L-1。按照正交設計L9(34)，采用3 因素3 水平，共9 個處理。每個處理接種10瓶，每組試驗重復3 次。培養基中均添加15 g·L-1蔗糖、8 g·L-1瓊脂、1 g·L-1活性炭，pH 值為5.8。培養條件為溫度25±2 ℃，濕度75%，光照強度為1800 lx，光暗處理時長各為12 h/d。恒溫生化培養箱中培養15 天后統計生根數及生根率，觀察生根情況并做好記錄。

1.2.6 數據處理及分析

試驗數據用WPS Office 2019 專業版統計匯總后，利用SPSS23.0 統計分析軟件進行多重比較分析。

愈傷組織誘導率(%)=（誘導出愈傷組織的外植體數/接種的外植體數）×100%

再分化率(%)=（產生芽點分化出芽苗的愈傷組織數量/接種的愈傷組織總數）×100%

生根率(%)=（生根苗數/接種苗數）×100%

2 結果與分析

2.1 不同培養基和不同植物生長調節劑配方對宜昌莢蒾愈傷組織誘導的影響

多重比較分析可知，基本培養基的種類、植物生長調節劑的濃度對愈傷組織誘導的影響顯著（P＜0.05）。使用N6 培養基時，誘導的愈傷組織質量差、誘導率較低，不是最佳的基本培養基，使用MS 和1/2MS 的愈傷組織誘導率較理想。添加不同濃度植物生長調節劑對愈傷組織的形成作用明顯，當6-BA 濃度升高時，愈傷組織誘導率下降，說明低濃度的6-BA 適合愈傷組織的誘導。當6-BA 添加濃度相同時，NAA 濃度高時，誘導率高，說明適當提高NAA 的濃度，有利于愈傷組織誘導。當6-BA 濃度為0.05mg·L-1、NAA 濃度為1.0mg·L-1、誘導率最高，為100%。該處理3 天左右葉片邊緣反向卷曲、膨大變厚，6 天左右形成黃綠色愈傷組織顆粒，顆粒較為密實，緊實度較高，15 天最終形成淡綠色愈傷組織（圖1），體積增大明顯，顆粒較為密實，緊實度較高，說明該處理為最佳處理。

圖1 為葉片脫分化后產生的愈傷組織圖

2.2 不同植物生長調節劑種類、濃度對愈傷組織再分化的影響

無菌條件下，將誘導出的愈傷組織嵌入到再分化培養基進行再分化培養。多重比較分析可知，植物生長調節劑的種類、濃度對愈傷組織再分化影響顯著（P＜0.05）。6-BA和TDZ 是不定芽分化時常用的2 種植物生長調節物質，6-BA 與TDZ 組合時濃度適宜有利于分化。當分化培養基中添加6-BA和TDZ 的濃度之和較低時，宜昌莢蒾愈傷組織再分化率低。提高TDZ 的濃度，愈傷組織分化率也隨之升高。培養基中同時添加IAA 的濃度是IBA 濃度的2 倍或接近2 倍時，有利于愈傷組織的再分化。由表2 可知，再分化的最佳培養基為N6+6-BA0.5 mg·L-1+TDZ0.7 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1。該處理14 天生成不定芽（圖2），高度為0.5 cm，葉片3～5 片，完成了再分化過程，分化率100%。從愈傷組織上剪取不定芽進行增殖培養（圖3），10 天產生大量愈傷組織的同時生成多個叢生芽（圖4），高度均超過3cm，葉片5～8 片，完成了組織培養擴繁過程，增殖系數為6.5。

圖2 為愈傷組織再分化產生不定芽的圖

圖3 為不定芽經增殖培養后莖的有效伸長的圖

圖4 為不定芽增殖擴繁的生長形態圖

圖5 為不定芽生成無根苗的圖

表1 不同基本培養基、不同植物生長調節劑配方對愈傷組織誘導的影響

表2 不同種類、濃度植物生長調節劑對愈傷組織再分化的影響

2.3 不同植物生長調節劑配方對宜昌莢蒾生根的影響

挑選宜昌莢蒾愈傷組織分化出的高度2～3 cm、葉片4～5 片的不定芽轉接到含有不同濃度植物生長調節劑的生根培養基中進行生根培養。由表3 的多重比較可知，在添加不同濃度植物生長調節劑的培養基中不定芽都能生根，但植物生長調節劑的種類、濃度對不定芽的生根影響顯著（P＜0.05）。在NAA 濃度小于0.3 mg·L-1的培養基中，根較細弱，植株矮小，長勢差。當NAA 濃度逐漸升高時，生根率也隨之增高。當NAA 的濃度為0.5 mg·L-1時，不定芽根較粗壯，植株生長速度較快。IBA 的濃度升高時，生根率也隨之提高。當生長素總濃度相同，添加相同濃度的NAA 和IBA時，添加NAA 的生根率高于添加IBA 的生根率，說明NAA 的生根效果優于IBA。添加6-BA 濃度為范圍為0～0.05 mg·L-1時，生根率逐漸提高，當濃度提高到0.1 mg·L-1時，生根率下降，說明添加微量6-BA 有助于生根。最佳生根培養基為1/2MS+6-BA0.05 mg·L-1+NAA0.50 mg·L-1+活性炭1g·L-1，15 天生根（圖6），生根2～3 條，根長2～3 cm，根粗0.2～0.3 mm，植株高度增長15%，完成了生根過程，生根率為100%，形成完整植株。

圖6 為生根的完整宜昌莢蒾植株

表3 不同種類、濃度植物生長調節劑對宜昌莢蒾生根的影響

3 討論與結論

建立宜昌莢蒾無菌體系，外植體的消毒處理，選擇消毒劑的種類、不同的消毒時間是無菌化處理的關鍵。宜昌莢蒾葉片表面不平整有凹陷，單一消毒劑的效果效果不佳，本研究采用75%乙醇和0.1%HgCl2組合消毒明顯提高消毒效果[12]，降低污染率，迅速建立宜昌莢蒾無菌體系。關于不同滅菌時間對外植體存活率和污染率的效果有待進一步研究，以期探究最佳消毒處理時間。本試驗能實現葉片快速脫分 化形成有效愈傷組織，愈傷組織誘導的最適培養基為1/2MS+6-BA0.05 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1，脫分化僅15 d 就能獲得色澤透明淺綠、結構致密的愈傷組織，其誘導率為100%.；對愈傷組織進行再分化培養14 d 后，就有不定芽形成，再分化的最佳培養基為N6+6-BA0.5 mg·L-1+TDZ0.7 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1，愈傷組織再分化率為100%。將不定芽進行生根培養，最佳生根培養基為1/2MS+6-BA0.05 mg·L-1+NAA0.50 mg·L-1+活性炭1g·L-1，培養15 天后生根率為100%。通過本試驗從建立無菌體系到植株生根，在組培室經展葉培養（10 d）、愈傷組織誘導（脫分化15 d）、不定芽發生（再分化14 d）、增殖培養（一個增殖周期是10 d）、生根培養（15 d），總計64 d 即可獲得大量完整的宜昌莢蒾植株，解決了宜昌莢蒾繁育困難的問題，并顯著提高了宜昌莢蒾的育苗效率，節約了生產成本，有利于宜昌莢蒾的種質資源的保存，為宜昌莢蒾工廠化育苗提供技術支持。