cGAS-STING通路異常激活及其抑制劑在免疫和炎癥疾病中的研究進展

李文欣,張賀峰,謝作權,段文虎

(中國科學院上海藥物研究所,上海 201203)

先天免疫應答通過模式識別受體來識別病原生物中的病原體相關模式分子(pathogen associated molecular pattern, PAMP)結構,進而促進I型干擾素(IFN-I)及其它細胞因子的表達,在機體抵御病原體入侵過程中承擔重要的角色。研究表明,在細胞損傷的情況下,核酸可以作為PAMP并引發強烈的免疫反應[1]。為了維持免疫系統的穩定,機體內的cGAS-STING通路將受到精準調控,其主要的感應器是環鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)。cGAS可以識別細胞質中的DNA并催化生成cGAMP(cyclic GMP-AMP),后者與干擾素基因刺激因子(STING)結合后會促進IFN-I和其他免疫介質的表達與分泌[2]。

先天免疫途徑的異常激活可導致強烈的IFN-I反應,進而引發自身免疫性疾病[3],因此使用抑制劑適當抑制cGAS-STING通路有望改善自身免疫和炎癥相關疾病。本文首先介紹了cGAS-STING通路及作用機制,其次闡述了該通路相關的免疫及炎癥疾病,最后概述了靶向cGAS-STING通路的抑制劑的研究進展。

1 cGAS-STING通路

1.1 cGAS催化cGAMP合成cGAS(Fig 1A)屬于核酸轉移酶家族,全長522個氨基酸,包含核苷酸轉移酶結構域和DNA結合結構域。其氨基端參與DNA結合;中間段為保守的核苷酸轉移酶基序NTase結構域;羧基端為Mab-21結構域并包含一個高度保守的鋅囊結構,具有識別DNA和合成cGAMP的功能。該鋅囊結構是cGAS識別雙鏈DNA的重要位點,通過結合Zn2+維持其蛋白結構作用和正常生理功能,抑制該結構將導致cGAS無法識別DNA。基于cGAS-DNA晶體結構的研究發現,作為細胞質DNA感受器的cGAS,主要通過與脫氧核糖磷酸骨架結合來識別雙鏈DNA,而這種識別沒有序列特異性,但結合的長度必須大于45個核苷酸,因此cGAS幾乎能夠識別所有類型的雙鏈DNA和部分單鏈DNA[4]。當與雙鏈DNA結合后,cGAS的R150和R192插入到DNA雙螺旋結構的空隙中,使cGAS-DNA復合體更加牢固[5]。

cGAMP的合成是啟動cGAS介導免疫反應的第一步。cGAS的催化活性是通過與DNA相互作用觸發的:cGAS依靠表面的正電荷和鋅囊結構吸引雙鏈DNA,與雙鏈DNA中的脫氧核糖磷酸骨架以2︰2的形式結合成多聚體,誘導cGAS的核酸轉移酶催化區域的構象發生變化,進而催化口袋可識別ATP和GTP底物,并合成2′,3′-cGAMP,而2′,3′-cGAMP可以進一步結合并激活下游的STING[6]。

cGAS作為一種模式識別受體,與細胞質DNA的檢測密切相關。cGAS不能識別特定的DNA序列,因此可以通過檢測內源性及外源性DNA從而調節免疫反應[7]。研究表明,cGAS不僅與外源性感染的免疫反應有關,還可以通過促進IFN-I來對DNA損傷劑、微核形成和細胞衰老誘導的基因毒性產生應激反應。因此,cGAS不僅是病原體的傳感器,也是細胞應激和基因組完整性的傳感器[8]。

1.2 cGAMP與STING的結合干擾素基因刺激因子STING也被稱為TMEM173、MPYS、MITA和ERIS,是參與先天免疫反應中的多個重要蛋白質分子之一。STING有多個跨膜結構域,在內皮細胞、上皮細胞以及造血肝細胞中均有表達。人源和鼠源的STING分別由379和378個氨基酸構成[9]。人源和鼠源的STING序列一致性為69%。人源STING由羧基端結構域和跨膜結構域組成(Fig 1B)?？缒そY構域由4個跨膜結構域組成,即TM1-4。羧基端結構域由配體結合域和羧基末端結構域組成。STING的羧基端結構域負責配體結合、蛋白質相互作用和信號轉導等功能。羧基末端尾包含保守的TANK結合激酶1(TBK1)結合位點。STING需要多聚化進而促進下游信號通路:據推測TBK1通過磷酸化STING的S358和S366來促進其聚合,而棕櫚?；疭TING的C88和C91促進其在高爾基體上的聚合。STING二聚體形成激活的STING單元,進而啟動下游效應器功能[10]。

Fig 1 Structure diagram of cGAS (1A) and human STING (1B)

內質網結合的STING是一種二聚體,其羧基端結構域延伸到細胞質中并形成“V”形配體結合口袋,與cGAMP結合并被激活后,從內質網轉移到高爾基。在STING易位之后激活下游信號通路所必需的關鍵修飾步驟——棕櫚?；痆11]。除了哺乳動物內源性合成的cGAMP之外,STING還可以被病原體的環狀二核苷酸(CDN)直接激活或被DNA損傷激活。CDN作為一種第二信使,普遍存在于原核生物和真核生物中。一般來說,內源性cGAMP或外源性CDN與STING配體結合口袋結合后,均可以促進STING下游信號通路[12]。

1.3 STING下游通路cGAMP作為第二信使被內質網表面的接頭分子STING識別后,通過STING的信號級聯效應誘導下游相關免疫及炎癥反應,進而促進宿主的免疫反應。但STING的異常激活會觸發過多的下游炎癥反應,甚至導致自身免疫性疾病的發生[13]。

研究表明,到達高爾基體后,棕櫚?；腟TING募集TBK1,進而磷酸化STING的羧基末端并募集轉錄因子干擾素調節因子3(IRF3)。隨后TBK1以STING依賴的方式磷酸化IRF3,導致IRF3二聚化并易位到細胞核,啟動IFN-I和其他免疫介質的表達[14]。此外,STING可以結合并刺激IкB激酶從而觸發NF-кB的轉錄激活,最終調節促炎細胞因子的表達和分泌,包括IFN-α和IFN-β。隨后,IFN與異二聚體IFN受體IFNAR1/IFNAR2結合激活Janus激酶1,它可以磷酸化信號轉導和轉錄激活因子,并誘導干擾素刺激基因(ISGs)的表達。ISGs通過靶向調節病原體生命周期來控制病毒、細菌和寄生蟲感染。有研究顯示,cGAS-STING信號通路也可以在相鄰細胞之間發揮作用,并可能通過在病毒顆粒中包裝cGAMP傳遞到更遠的細胞組織[15]。cGAS-STING通路的信號傳導途徑見Fig 2。

Fig 2 cGAS-STING signaling pathway

2 cGAS-STING異常激活與疾病

cGAS-STING通路是主要的細胞質DNA傳感通路。異常激活的cGAS-STING通路涉及多種炎癥過程和自身免疫性疾病,根據引發疾病的方式主要分為兩類:一類是DNA異常累積,導致cGAS-STING通路持續激活,誘導IFN-I等炎癥細胞因子的持續釋放;另一類是STING自身突變,導致其不再依賴上游信號并持續激活,進而引發自身免疫性疾病[16]。

2.1 DNA異常累積通常,細胞DNA被限制在細胞核或線粒體中。盡管降解DNA的核酸酶相當豐富,但自身DNA仍然可以通過多種機制在細胞質累積。細胞核和線粒體DNA的錯誤定位以及cGAS無法區分外源和自身DNA這兩者共同促進了自身免疫性疾病的發生。例如,共濟失調毛細血管擴張癥[17]是一種傷及神經、血管、皮膚的原發性免疫缺陷疾病,是由于細胞質中存在未配對的DNA而引起IFN-I產生,表現為進行性共濟失調、免疫功能缺陷、眼結膜和皮膚毛細血管擴張以及腫瘤傾向等。

體內的DNA酶通過降低細胞質DNA水平來抑制cGAS檢測自身DNA。三素修復核酸外切酶1(Trex1)和脫氧核糖核酸酶II分別降解細胞質和溶酶體中的DNA,當人體中這兩種脫氧核糖核酸酶發生突變,則會導致自身DNA的過度積累,從而激活cGAS,引發IFN-I依賴性自身免疫性疾病。例如,Trex1功能喪失突變導致自身DNA的過度積累[18],引發Aicardi-Goutieres綜合征和系統性紅斑狼瘡等疾病;脫氧核糖核酸酶II的缺乏阻止清除死亡細胞釋放的DNA和細胞核中泄漏的DNA,這也促進了cGAS激活和IFN-I依賴性自身免疫性疾病的發生,如類風濕性關節炎等[19]。

此外,DNA異常累積還涉及代謝與炎癥性疾病。在急性胰腺炎模型中,壞死組織泄露的外源性DNA誘導大量炎癥因子產生,造成組織損傷,而敲除cGAS和STING基因的小鼠病癥有所緩解。在非酒精性脂肪肝中,同樣發現cGAS和STING基因敲除的小鼠中得到了改善[20]。因此,抑制cGAS-STING通路還可能用于某些代謝疾病及炎癥疾病的治療。

2.2 STING突變配體無關的STING激活案例最早發現于一種罕見的獲得性突變相關自身炎癥性疾病中。由于在臨床上發現此類疾病早發于嬰兒時期,故命名為STING相關幼年發病性血管病變(SAVI)[18]。隨后,在STING上的兩個獨立區域中鑒定出幾個突變殘基,即二聚化界面(V147L、N154S、V155M和G166E)和聚合界面(C206Y、R281Q、R284S和R284G)。結構分析表明,V147L、N154S和V155M誘導STING細胞質結構域180°旋轉,而C206Y、R281Q、R284S和R284G突變體減輕了STING寡聚化的自身抑制,從而導致STING自發性寡聚化和在高爾基體的積累。突變STING在這些患者的成纖維細胞中積累并激活下游,即使在沒有cGAMP的情況下,STING信號通路也可以持續激活[21]。這些STING突變體在SAVI患者中自動激活會造成嚴重的肺部炎癥、廣泛的皮膚血管病變、全身炎癥、聯合免疫缺陷,甚至導致死亡。

3 cGAS-STING通路抑制劑

cGAS-STING通路異常激活會引發自身免疫性疾病,通過特定的化學分子抑制cGAS-STING通路有望改善這些疾病[22](Fig 3)。

3.1 cGAS抑制劑Jiang等[23]報道了乙?；揎検强刂芻GAS活性的關鍵分子事件,發現K384、K394和K414位點的乙?；軌蛞种芻GAS活化。首先在細胞內對模擬乙酰化的cGAS突變體進行功能評價,初步發現乙?；揎棇GAS的抑制作用。其后利用CRISPR-Cas9基因編輯技術、體外定點乙?；鞍准兓到y、cGAMP定量分析技術等驗證了乙?；揎棇GAS的抑制作用。通過對cGAS乙?；揎椢稽c的分析,最終證明了阿司匹林可以直接乙?；痗GAS,并且在細胞及動物水平驗證了阿司匹林的作用,能夠有效抑制AGS患者細胞和小鼠模型中自身DNA誘導的自身免疫。

Vincent等[24]通過高通量篩選發現一系列活性化合物。代表性化合物RU.521表現出良好的細胞活性和選擇性。通過等溫滴定量熱法測得其對cGAS的Kd為36 nmol·L-1。在細胞試驗中測得RU.521對DNA誘導的原始巨噬細胞中cGAS信號通路的IC50為0.70 μmol·L-1。RU.521降低了Aicardi-Goutières綜合征小鼠模型巨噬細胞中干擾素的表達。RU.521與cGAS結合的晶體結構確證其占據了cGAS的活性位點,并且RU.521有助于進一步了解cGAS的生物學作用。

3.2 STING的CDN口袋抑制劑Astin C是一種源自紫菀的天然環肽。Li等[25]研究發現,Astin C可抑制cGAS-STING信號傳導,從而減輕Trex1-/-鼠模型和巨噬細胞的自身炎癥反應。研究小組發現Astin C與STING的羧基端激活口袋特異性結合,通過作用于結合口袋阻止IRF3募集,同時保持完整的STING-TBK1相互作用。盡管Astin C結合親和力較低,但Astin C在小鼠模型上具有較好的耐受性和較低的細胞毒副作用,有望通過進一步改造提高親和力,發現具有較大治療窗的STING抑制劑。

Hong等[26]發現了一類能夠與cGAMP競爭結合STING的抑制劑。研究以計算機對接的方式確定了一種有效的STING抑制劑SN-011,它與STING的CDN結合口袋的親和力高于cGAMP,其IC50為76 nmol·L-1。SN-011將STING鎖定在開放的非活性構象中,從而抑制由2′3′-cGAMP、單純皰疹病毒1型感染、Trex1缺乏、cGAS-STING過量表達或其他因素激活的IFN-I和炎性細胞因子的產生。在Trex1-/-小鼠中,SN-011表現出良好的耐受性。SN-011作為與CDN結合口袋結合的特異性STING抑制劑,是治療STING異常激活相關疾病中有前景的先導化合物之一。

Fig 3 Structure of inhibitors of cGAS-STING pathway

3.3 STING棕櫚酰化抑制劑STING棕櫚酰化是促進高爾基體上的STING聚集和隨后募集STING下游信號分子的關鍵過程之一。

2018年,Haag等[27]發現,化合物H-151通過共價修飾STING的C91殘基來阻斷棕櫚酰化誘導的STING聚集。該類共價抑制劑結合在STING的連接跨膜結構域,從而阻止STING獲得活性構象。研究表明,在Trex1-/-鼠模型和人類細胞中,H-151有效抑制人源STING棕櫚?；?IC50<1 μmol·L-1),并降低了TBK1磷酸水平及IFN-I反應。化合物H-151具有活性強、分子量低、配體效率高和藥代動力學性質好的特點,是極具潛力的候選藥物。

硝基脂肪酸(NO2-FAs)是內源性形成的脂肪酸,介導抗炎、抗氧化和細胞保護作用。Hansen等[28]報道NO2-FAs可以通過硝基烷基化共價修飾STING,具體是將STING的C88和C91的硫醇基團硝基烷基化。該共價修飾將阻斷STING棕櫚酰化和信號傳導,抑制IFN-I的產生。經驗證,NO2-FAs可以抑制SAVI患者的成纖維細胞中IFN-I的產生。NO2-FAs的五項I期臨床試驗已證明了NO2-FAs的良好耐受性。

3.4 TBK1抑制劑葛蘭素史克公司[29]報道了一種新的高效和高選擇性的TBK1抑制劑GSK8612的發現和特性。在細胞檢測中,該小分子抑制了Ramos細胞中Toll樣受體3誘導的IFN-Ⅲ的磷酸化,并抑制了人類原代單核細胞中IFN-I的分泌。在單核巨噬細胞中,GSK8612能夠響應雙鏈DNA和cGAMP而抑制IFN-β的分泌。GSK8612作為一種TBK1小分子抑制劑,是進一步分析TBK1在免疫、神經炎癥、肥胖或癌癥模型中的生物學特性的理想探針。

4 總結與展望

近年來,研究人員投入了大量的精力和資源來研究cGAS-STING通路,從而推進了cGAS和STING抑制劑的在免疫和炎癥疾病中的應用[30]。從結構和功能的角度來看:在上游,cGAS作為DNA傳感器,通過合成cGAMP引發后續通路;在下游,TBK1和IRF3的募集和磷酸化現在也被確立為免疫激活的關鍵機制之一;對處在中心的STING,其與配體識別后構象的變化和翻譯后修飾的機制也有了較清晰的認識,通過抑制棕櫚酰化和占據CDN口袋這兩種方式來抑制STING策略已經得到證實。cGAS-STING通路異常與多種自身免疫性疾病的關系也逐漸明晰。

作為核心調控蛋白的STING不僅接受來自宿主DNA的受損信號,還對基因突變和內質網應激做出反應,從而參與多種自身免疫和炎癥疾病的調控。從這一點出發,靶向STING比靶向上游cGAS或下游TBK1在藥物發現中可能更可取。基于這些已鑒定的先導化合物的母核結構,需進行結構優化以提高其生物活性、靶標選擇性和藥物吸收,同時盡量減少毒性作用。此外,從生物活性的角度來看,基于生化的高通量篩選中發現的cGAS-STING通路抑制劑對細胞層面的測定幾乎沒有影響。因此,未來可首選基于細胞的高通量方法進行藥物篩選。同時,新技術的開發與應用,例如蛋白水解靶向聯合體利用泛素-蛋白酶體系統對靶蛋白進行降解的藥物開發技術,為阻斷cGAS-STING信號傳導提供了新途徑。目前,cGAS-STING通路抑制劑為治療自身免疫性疾病提供了良好的策略,預計在不久的將來,高效低毒的cGAS-STING通路抑制劑將會被開發并最終應用于臨床。