雌性激素受體甲基化與中樞神經系統疾病的研究進展

劉 宏,黃 楊,溫 薇,趙 莉,楊 婧,高冰清,代巧妹

(黑龍江中醫藥大學 1. 基礎醫學院、2. 研究生學院,黑龍江 哈爾濱 150040; 3大連醫科大學中西醫結合學院, 遼寧 大連 116044)

雌激素是一種重要的生理激素,在體內各生理系統均發揮著重要的調節作用,雌激素主要通過雌激素受體蛋白所介導的雌激素受體發揮生理功能[1]。雌激素受體在體內各處均有表達,同時也可以調節大腦結構和功能,增加神經元數量,改變樹突結構,修復突觸受損部位,發揮神經保護作用。近年來,表觀遺傳領域頗受青睞,在各種疾病發展過程中也?？蓪て渖碛?。隨著雌激素受體甲基化研究日益深入,人們對其在中樞神經系統中的作用愈加關注,雖然甲基化檢測手段日新月異,但雌激素受體甲基化具體作用卻不甚明確。本文就雌激素受體的結構、分布、甲基化過程以及在不同中樞神經系統疾病過程中發揮的作用進行總結與闡述。

1 雌激素及其受體甲基化

1.1 雌激素及其受體雌激素是一種甾體激素,屬于類固醇,其合成主要位于卵泡內,少部分在腦中進行。目前發現的雌激素受體主要包括核受體和膜受體。

1.1.1經典的核受體(ERα和ERβ) 典型的雌激素核受體(ERα和ERβ)包含了A、B、C、D、E、F 5種功能區域,但兩者結構不全然相同。A/B區位于氨基末端結構域(n-terminal domain, NTD),是轉錄激活功能區(AF-1),同時也是兩種受體結構差異最大的區域。C區對應于DNA結合結構域(DNA-binding domain, DBD),在序列特異性DNA結合和受體二聚化中具有重要作用,ERα和ERβ在此有97%的同源性。D結構域是連接C和E結構域的鉸鏈區域,作用是和DNA結合。羧基末端是E / F區域,也稱為配體結合域,即雌激素應答元件。包含雌激素結合區,以及共激活劑和核心加壓劑的結合位點[2]。最后,雌激素受體轉錄活性的另外兩個調節因子稱為激活功能(AF)結構域AF1和AF2,分別位于NTD和配體結合域(ligand-binding domain,LBD)內。兩受體功能區域和結構部位氨基酸(amino acid,AA)長度對比。

Fig 1 Structural diagram of various parts of estrogen nuclear receptor

1.1.2膜性受體 膜性受體含有經典核受體的膜性成分以及屬于G蛋白偶聯受體家族的GPER1(GPR30)、Gaq-ER和ER-X。其中GPR30發揮作用最為突出,GPR30的基因位于7號染色體(位點7p22.3)。就結構而言,GPER1與ERα或ERβ沒有相似之處。作為典型的G蛋白偶聯受體,其結構由7個跨膜α-螺旋區、4個細胞外段和4個胞質段組成,其DNA 序列的長度為2 604 bp,其中包含一個開放閱讀框(其長度1 128 bp)。與其他雌激素受體相比,該受體對雌二醇(E2)具有較低的結合親和力,但分布較更為廣泛。除雌激素及其作用的靶器官和細胞膜、內質網、線粒體及高爾基復合體外,在骨骼肌、神經元、血管內皮和多種免疫細胞也有表達。此外ER-X富集于動物出生后類囊狀微區,分子量為63 ku,在胎兒狒狒腦中分布較多,正常成年人含量基本為零,一般很難檢查出來。有研究發現,當腦部缺血損傷時可被檢測到,還需進一步研究其作用。雌激素受體具體分布位置,見Tab 1[3-5]。

2 雌激素受體信號通路及其甲基化

2.1 雌激素受體信號通路雌激素作為一種類固醇激素,可以直接通過質膜與細胞內的ERα和ERβ相互作用,通過與DNA序列結合來發揮直接作用,或者與GPER1和ERα和ERβ的相互作用來激活細胞內信號級聯反應。由于細胞和分子事件的差異導致基因表達調節不同,其中雌激素受體復合物可以直接或間接地與DNA結合。雌激素介導的信號傳導事件可以分為基因組和非基因組?；蚪M機制涉及基因轉錄,主由核 ER介導,以及在稱為雌激素反應元件(EREs)的特定DNA序列上與染色質的直接相互作用[6]。非基因組作用模式由膜性受體介導,首先使細胞內的第二信使被激活,從而產生更多的反應,比如抗氧化和興奮細胞等作用。

在中樞神經系統疾病中,雌激素受體對中樞神經系統的保護尤為關鍵。更年期雌激素水平下降可導致婦女出現情緒波動、認知功能的變化和記憶力減退。腦源性神經營養因子(BDNF)可以調節突觸可塑性,當ERβ被激活時,小鼠腦中的BDNF蛋白顯著增加,極大增強了腦部神經元分化能力,有效緩解記憶缺失癥狀。Broughton等[7]首次發現,在腦血管內皮細胞GPER-1也廣泛表達,而且雄性小鼠腦GPER-1表達隨著腦缺血程度增加而增加。種種跡象表明,雌激素受體在腦部神經系統疾病的發生發展進展中發揮重要作用。

2.2 雌激素受體甲基化雌激素甲基化過程中,在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的催化下,甲基從S-腺苷酸甲硫氨酸(SAM)轉移到胞嘧啶殘基的5-碳,從而在基因啟動子胞嘧啶(C)-磷酸(p)-鳥嘌呤(CpG島)[8]中形成5-甲基胞嘧啶(5mC)。CpG島的表觀遺傳修飾改變了基因表達模式。當一個基因的啟動子區域或轉錄結合位點甲基化程度變高時,它會抑制轉錄活性。因為雌激素受體本身不與任何DNMT酶結合。例如,ERα就會招募共同調節因子,如核受體相互作用蛋白(NRIP1);隨后招募額外的輔抑制因子,如組蛋白去乙?；?HDAC1)和多梳復合物2(PRC2)。組蛋白3(H3)和組蛋白4(H4)具有特別長尾,因此最常被修改。HDAC和zeste同源物2(EZH2)增強子(PRC2的酶促部分)首先使活化組蛋白標記脫乙酰,然后在啟動子核小體中的組蛋白賴氨酸殘基上放置抑制性甲基。EZH2和NurD在內的的PRC2復合物與DNA甲基轉移酶復合物(DNMT3a、DNMT3b、DNMT3l)結合,然后DNMT使CpG島甲基化[9-10]。總之,連接體ERα通過影響CpG島中組蛋白和胞嘧啶殘基的甲基化狀態在基因轉錄調控中發揮作用。ERs在甲基化過程中招募共同抑制子(HDAC1、PRC2)和不同的蛋白質復合物(PRC2、NurD)。ERα、輔抑制因子和不同蛋白復合物之間的相互作用導致雌激素反應元件中CpG島甲基化。僅激活DNMT是不夠的,染色質重塑和組蛋白的甲基化也是阻止基因轉錄的關鍵。

3 雌激素受體甲基化與中樞神經系統疾病

雌激素和中樞神經系統疾病關系異常密切,本身雌激素具有一定的脂溶性,所以可以透過血腦屏障進入中樞神經系統,且雌激素也可以在腦部合成,通過重建突觸,提高腦部血流量,促進神經再生。一般而言,雌激素受體發揮保護神經的作用主要通過擴張血管、增加腦部血流量、調節血管一氧化氮(nitric oxide, NO)水平、抑制動脈粥樣硬化、拮抗興奮性氨基酸(excitatory amino acids, EAA)毒性、抑制炎性因子表達、調控下丘腦-垂體-腎上腺軸、改善ERK信號通路、提高多巴胺等神經遞質合成、減低PI3K/Akt 磷酸化、調節細胞內Ca2+水平、抑制β淀粉樣變性,從而促進神經細胞增生,改善記憶和認知功能,營養保護神經系統。

3.1 雌激素受體甲基化與腦缺血卒中缺血性腦卒中是指由于腦部組織缺血缺氧導致部分區域神經功能發生改變。流行病學研究發現,絕經前婦女心腦血管疾病的發病率較低,而絕經后婦女與男子之間沒有顯著差異。相關實驗表明,在成年嚙齒動物皮層中,ERα啟動子高度甲基化,但在神經元缺血性損傷后甲基化水平急劇而迅速地下降,這也解釋了雌激素受體在腦缺血模型中對血管具有保護作用[11]。腦缺血/再灌注期間血管功能發生障礙,而NO是重要的血管舒張因子,影響血管的舒縮變化,雌激素通過結合其特異性受體,提高一氧化氮合酶基因表達[12],抑制血管平滑肌細胞的遷移和增殖來降低動脈硬化程度。缺血性腦卒中獨立危險因素之一是同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)的改變,通過甲硫氨酸循環產生S-腺苷酸甲硫氨酸,從而改變DNA的甲基化狀態,導致多種疾病的發生。劉松等[13]學者通過對狹窄大腦中動脈斑塊雌激素受體ERα基因甲基化狀態的研究發現,隨著ERα甲基化和Hcy的升高,顱內不穩定斑塊的形成加速。這也為腦血管病易感患者的篩檢和識別提供依據。

Tab 1 Characteristics and distribution of estrogen receptor

Fig 2 Estrogen receptor methylation process

腦缺血時,腦內釋放出大量的EAA,造成鈣離子內流,氧自由基增多,從而對神經元造成損傷,而雌激素和谷氨酸受體大量共存細胞內,通過同一細胞受體,降低其自身受體甲基化水平來干擾EAA代謝,清除氧自由基,保護神經元。同時腦部缺血損傷也會導致促炎癥因子比如IL-1β的上調,IL-1β通過激活β-連環蛋白途徑對上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)進行誘導,轉錄因子TWIST1的上調使得ERα基因啟動子的甲基化水平下降,進而抑制膠質細胞的活化。細胞凋亡是腦缺血損傷后的重要表現,長期低氧會導致神經元內質網損傷,從而促使相關細胞凋亡。雌激素受體GPER激活,對內質網應激產生抑制,從而減少了神經元細胞的死亡,緩解腦缺血/再灌注損傷,其機制在韓子偉等[14]模擬腦缺血中GPER對內質網細胞凋亡研究中得以論證。有趣的是,ERβ基因多態性存在種族、地域上的差異,其不同基因酶切多態性使得腦缺血患者患病的易感性和年齡表達存在著不同的影響。這與ERα基因表達恰恰相反。兩受體甲基化在腦缺血疾病中的表達差異有待進一步研究其機制。

3.2 雌激素受體甲基化與抑郁癥抑郁癥是一種高患病率、高自殺率及高復發率的腦部神經退行性疾病。圍絕經期抑郁癥高發于卵巢退化后的中老年人群,一些調查報告顯示出雌激素受體水平的波動與圍絕經期抑郁癥的易感性密切相關。動物實驗表明,老年雌性大鼠中當雌激素受體處于低甲基化狀態時,可以調節外在刺激對機體的反應,增強了腦部神經的保護,一定程度上減少了抑郁行為的發生。其中ERαrs9340799 AA基因型和rs2234693 TT基因型已被證明與絕經后激素使用修飾的終生抑郁風險相關,而ER-βrs4986938 AA基因型也與重性抑郁癥的患病率較高有關[15]。通常而言,抑郁癥會導致HPA軸的糖皮質激素分泌增加,從而使促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin-releasing honnone, CRH)分泌過多,而雌激素可以通過其受體影響CRH水平,進而影響下丘腦-垂體-腎上腺軸,從而減輕焦慮和抑郁樣行為發生。Birgit等[16]利用亞硫酸氫鹽測序測定CRH基因中啟動子特異性CpG甲基化。染色質免疫沉淀(ChIP)測定用于確定ERβ與CRH基因近端啟動子區域的結合,隨著ERβ甲基化程度增加,抑郁行為普遍增加。

細胞外調節蛋白激酶ERK信號通路是研究抑郁癥發病機制的另一路徑。雌激素通過激活BDNF受體TRK來激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK),從而活化ERKK1/2調節基因轉錄,發揮抗抑郁作用。宮谷谷等作者利用ERβ選擇性激動劑二苯基丙腈來測試小鼠抑郁作用中BDNF的表達,發現低甲基化狀態下ERβ增加了海馬CA1中的PERK1/2表達,從而發揮抗抑郁作用[17]。神經遞質假說在抑郁癥的發病機制研究中占據很大一部分。其中5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)是重要的中樞神經遞質,參與HPG軸功能調節。雌激素受體激活可增加中縫背核中5-HT的合成,同時5-HT通過5-HT受體(5-HTA)的激活從而發揮其抗抑郁的作用。Kajta等[18]通過藥物誘導小鼠模擬成人產生抑郁行為,通過氣相色譜法和串聯質譜法確定的產前給藥在小鼠大腦中積累,導致整體雌激素受體的DNA低甲基化,并改變特定基因中甲基化DNA的水平。抑郁樣行為的誘導和Htr1a/5-HT信號傳導的損害,發現GPER1甲基化提高在藥物誘導的抑郁樣癥狀的傳播中起關鍵作用。現代研究發現,動物海馬體中炎癥細胞的增加也會導致抑郁行為。一種名為NLRP3炎癥小體出現在視野之中,它參與了因雌激素缺乏而導致的情感障礙類疾病。徐永軍等[19]通過對炎癥因子的研究,發現雌激素的缺乏,其受體高甲基化的表達會導致NLRP3炎癥小體活化,從而導致海馬體神經炎癥以及抑郁和焦慮。這可能是以后治療雌激素缺乏導致抑郁癥疾病的潛在方向。

3.3 雌激素受體甲基化與阿爾茨海默病(AD)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是指患者伴有認知功能減退、人格及行為障礙為特征,表現一類腦部神經系統病變疾病。其中β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積,線粒體功能障礙和氧化應激反應,Tau蛋白異常以及Ca2+的流失是導致AD發病的主要原因。AD在絕經后婦女中更普遍。腦源性雌激素的消耗是 AD 發展的重要機制。腦萎縮是AD 主要的病理改變。雌激素受體的激活可以增強神經的可塑性,這與學習記憶的形成和改變密切相關。亞諾夫等[20]通過術后切除卵巢年輕和年老的Fischer大鼠,來檢測海馬CA1和CA3區Esr1表達和ERα啟動子甲基化。研究發現,相對于CA3,CA1區Esr1表達降低與CA1區DNA甲基化增加有關,尤其是第一個CpG位點。此外,遠端CpG位點11-17的差異甲基化與衰老期間或長期激素缺乏后Esr1表達的改變有關。

AD主要病理特征為過度磷酸化的Tau蛋白異常集聚形成的神經纖維纏結。更年期AD患者的大腦中雌激素缺乏。淀粉蛋白質(Abeta)和雌激素缺乏癥都可以與tau激酶相互作用。實驗表明,蛋白質磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)可能是ER表達的決定因素,雌激素受體的高甲基化導致PP2A(L309)去甲基化增加使AD大腦中PP2A活性降低,導致異常高磷酸化tau的去磷酸化功能受損。而ERα36基因沉默可以抑制ERK/AKT信號通路的激活,增加tau蛋白磷酸化。但Xiong等[21]在研究兩種雌激素受體時,發現二者對AD患者中Tau蛋白磷酸化發揮了不同的作用,ERα增加miR-218的表達,以抑制其特異性靶標蛋白質酪氨酸磷酸酶α(protein tyrosine phosphatase α,PTPα)的蛋白質水平。PTPα的下調導致糖原合酶激酶-3β(導致活化)和蛋白質磷酸酶2A(導致失活)的異常酪氨酸高磷酸化。相反,ERβ通過限制miR-218水平和恢復miR-218水平,以此拮抗ERβ對tau磷酸化的衰減來抑制tau磷酸化。Ca2+信號在維持正常的腦功能中起著非常重要的作用,雌激素受體激動劑可有效加快神經元細胞內的Ca2+內流,加快了ERK 磷酸化,對神經起到保護作用,伴隨著ERα的高甲基化會抑制Ca2+的內流。

淀粉樣前體蛋白(APP)可以被α-、β-、γ-蛋白酶分解產生Aβ。而Aβ會對腦部神經產生很強的毒性,引發腦部神經元死亡病變。Tang等[22]通過在HEK293細胞中加入達全長的淀粉樣前體蛋白(β-amyloid protein precursor,APP),發現低甲基化狀態下的ERα對APP的合成過程起到了一定的抑制作用,且減弱了GSK3β活性。AD中ERβ的作用也不可忽視,在部分AD病人腦中發現其核ERβ數量顯著下降。TIan等[23]發現,在老年大鼠AD模型中ERβ的低甲基化表達減少了海馬體中的Aβ沉積,有效改善了其記憶下降問題。當然,既往的研究中氧化應激損傷和線粒體功能障礙也與AD有關。隨著AD患者大腦中雌激素受體水平下降,線粒體氧化酶活性也同時降低,雌激素受體甲基化的高表達會導致線粒體功能障礙,腦部能量儲備下降,誘發AD發病。

3.4 雌激素受體甲基化與帕金森病(PD)帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的神經系統變性疾病,最主要的病理改變是中腦黑質多巴胺(dopamine,DA)能神經元的變性死亡。雌激素受體ERα、ERβ和GPR30在紋狀體和黑質中均已被證明存在,其中ERα是作用于神經保護的主體。陳榮杰等[24]利用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性方法,對PD患者進行ERβ基因多態性分析,發現ERβ基因AluⅠ、RsaⅠ的酶切多態性不影響 PD 和 PDD 的患病風險。Kim等[25]。研究發現,雌激素受體ERβ低甲基化可以誘導RNF146的激活,從而對PAR聚合酶-1(PARP1)誘導的中風細胞死亡具有神經保護作用,可以預防由PD引起的細胞死亡。

炎癥反應在PD中起著關鍵作用,藥理學研究發現,當GPR30通過與雷諾昔芬結合時可發揮抑炎作用,從而抑制PD的慢性炎癥進展。ER可以激活AKt信號轉導機制,使其磷酸化,誘導Bcl-2等靶基因的表達。生育三烯酚(tocotrienols,T3s)是維生素E家族的成員,具有抗氧化特性,并且在PD等神經退行性疾病的發病機制中是起神經保護作用。雌激素受體ERβ作為γT3/δT3刺激后PI3K/Akt信號傳導的上游介質。高度純化的γT3/δT3直接在體外與ERβ結合,并且在SH-SY5Y細胞中敲除ERβ可消除γT3/δT3依賴性細胞保護和Akt磷酸化。這從側面反映出ERβ甲基化表達水平的高低是直接影響T3治療后早期PD發展的關鍵步驟。同時,一種噻二唑丙烯酰胺衍生物(XCT790)作為最具選擇性ERα反向激動劑應用于PD的治療。一般情況下,當ERα存在于自噬體中時,隨著化合物的誘導自噬反應的增加,這種定位卻并沒有隨之喪失,這說明ERα可以通過其自身動力學來調節這種反應。在相關模擬臨床小鼠PD的模型中我們不難看出,一定條件下,自噬作用通過抑制ERα的活性,致使其甲基化水平提高。XCT790通過誘導自噬清除有毒蛋白聚集體,同時緩解運動協調障礙,并對黑質中的多巴胺能神經元發揮神經保護作用,消除了神經元細胞中α-突觸核蛋白,這也為我們治療PD提供了一個新的思路。

胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)是一種內源性肽,通過與雌激素受體相互作用,從而增強對大腦神經的保護。IGF-1可以改善MPTP誘導的運動缺陷,改善紋狀體中DA及其代謝物含量的降低以及黑質(substantia nigra,SN)中TH-IR神經元的損失。實驗表明[26],GPER的低甲基化激活可能有助于IGF-1的表達。從而對MPTP / MPP誘導的多巴胺能神經元損傷的神經保護作用。

3.5 雌激素受體甲基化與精神分裂癥精神分裂癥是一種由多組癥狀群組成的慢性疾病,臨床表現各異。該病發病機制不明確,現代研究認為可能與海馬代謝失調、前脈沖抑制(prepulse inhibition,PPI)等有關。通常女性發病較同齡男性晚,且在絕經期和產后期發病幾率增加。精神分裂癥的主要特征是大腦信息加工過載,同時感覺運動門控受損是導致該異常的重要機制之一。在利用苯丙胺誘導小鼠精神分裂癥模型中,在基礎條件下,使用 ERα或ERβ激動劑進行預處理可有效阻斷苯丙胺誘導的PPI破壞。使用優先ERβ調節劑進行急性治療可避免PPI[27]。說明雌激素受體低甲基化狀態下可以增強PPI從而減緩病情發展。隨著年齡的增加,其腦部海馬區域的ERα甲基化表達水平下降。

有研究表明,ERα其中一個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點在精神分裂癥患者中普遍存在,同時它與患者前額葉的ERα甲基化高低息息相關[28]。但是,在研究過程中發現多巴胺失調也會引起精神分裂癥出現,在精神分裂癥患者腦中海馬神經元常常出現異常,這在雌激素缺乏患者中更為常見。當抗精神病藥物和雌激素受體結合時往往效果更好。但許多患者對這些精神病藥物容易上癮,當臨床反復用藥時,多巴胺釋放明顯減少[29]。此類研究目前尚處于實驗觀察階段,后續期待更多的發現。

4 結語

伴隨著雌激素的衰退和身體機能的下降,腦部中樞神經系統疾病發病率不斷提高,且雌激素主要通過其受體對中樞神經系統機制產生作用。表觀遺傳學是近年來興起的學科,它從DNA基因角度揭示了相關腦部神經系統疾病的發病病因。雌激素受體甲基化對腦部疾病國內研究不甚很多,其作用機制尚不明確,還有許多問題和難點去研究,與相關疾病的研究才剛剛開始,尚需要對表觀遺傳修飾關系展開進一步的研究,以期揭示其具體作用機制。